犬细小病毒疾病是由细小病毒科成员犬细小病毒(CPV)感染引起的,是一种高危险性、高接触性、呈急性发病的烈性传染病。该病传染性强和死亡率高的特点给我国犬类及宠物饲养业造成了极大的经济损失和影响。目前应用于临床治疗的抗犬细小病毒单克隆抗体都是鼠源的,应用于犬体治疗时存在被免疫系统识别产生犬抗鼠抗体,很快被清除等问题;另一方面,单克隆抗体基因容易在较长的传代过程中丢失,且在真核细胞中获得抗体的方法成本很高。因此,近年来单链抗体(scFv)由于其免疫原性弱,相较简单和低成本的制备工艺而发展为目前研究最多的基因工程抗体之一。为了获得成本低且具有治疗效果的scFv,减小犬细小病毒病的临床治疗压力,本研究旨在利用大肠杆菌表达系统制备抗CPV的scFv,检测其生物活性并进行初步应用。方法为以实验室前期制备获得的,可以分泌具有中和活性的抗CPV VP2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株为基础,提取该杂交瘤细胞的总RNA,反转录合成cDNA链,以此为模板扩增并获得了抗体的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因;将可变区基因连接至原核表达载体pOPE101,成功构建重组质粒pOPE-scFv;测序结果与抗体基因数据库比对,获得了抗体可变区序列,VH基因大小为387bp,VL基因大小为393bp。重组质粒转化XL1-blue感受态细胞经IPTG诱导表达,经SD S-PAGE和Western blot验证分析蛋白大小约为35ku,与预期结果相符。为了提高scFv的表达量,构建了同时表达抗体可变区基因、Erv1基因以及DsbC基因的重组质粒pET23b-GB,经转化Rosetta感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE和Western blot结果表明scFv表达量得到明显提高且可以被抗His标签抗体识别。利用His标签树脂亲和层析纯化scFv浓度为1.120mg/mL;经酶联免疫吸附试验(ELISA)结果表明原核表达的scFv可与VP2蛋白抗原结合活性;经间接免疫荧光实验表明scFv可与CPV和FPV特异性结合;经微量细胞中和实验证明scFv保留了中和CPV和FPV的活性,对CPV的中和效价为1:40(0.028mg/mL),对FPV中和效价为1:20(0.056mg/mL)。建立感染CPV动物模型,发病犬在连续注射scFv 3天后恢复健康,证明原核表达的scF v可以对感染CPV的犬产生治疗保护效果。本研究获得了抗CPV VP2蛋白抗体的可变区序列,在实现原核表达的基础上提升了其表达量,经以上研究结果表明本研究制备的scFv具有治疗犬细小病毒病的应用前景。