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目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是多种病因引起的以慢性高血糖为主要特征,导致多组织系统病变的代谢紊乱综合征。肺脏作为糖尿病损害的靶器官之一,其损害主要表现为肺通气功能障碍、弥散功能障碍、基底膜增厚、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成和/或降解代谢失衡,肺间质增厚,最终导致肺纤维化的发生。目前糖尿病肺纤维化的发病机制尚未明确。持续高血糖引起的蛋白质非酶糖基化可形成晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs),AGEs与其受体(receptor of advanced glycation end products,RAGEs)结合可启动细胞内信号转导途径,激活一系列细胞介导反应,导致细胞因子和生长因子生成和释放,引起组织修复和蛋白变性。转化生长因子-β1(transforming growthfactor-β1 TGF-β1)参与细胞生长、增殖、分化和移行,介导细胞凋亡,调节ECM的代谢。在多种促纤维化细胞因子中,TGF-β1被公认为是与肺纤维化发生发展关系最为密切的因子之一。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)及其抑制物(inhibitor of matrixmetalloproteinases,TIMPs)在ECM代谢中起重要作用,明胶酶B(MMP-9)主要降解弹性蛋白、Ⅳ胶原、LM基膜等ECM成分,导致肺基膜及结构支架受损。TIMP-1可抑制MMP-9的活性而影响ECM的降解,MMP-9和TIMP-1的表达及活性改变可能参与了糖尿病肺纤维化的病变过程。冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc是麦角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体,是一种名贵中药材,具有滋肺补肾、止血化痰、保肺、止痨嗽有调节免疫系统功能等多种功效。罗格列酮(rosiglitaazone,RSG)是噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂,通过激活过氧化物酶体增殖活化受体γ(peroxisome pmlifemtors activated receptor,PPARγ)发挥调节糖、脂质代谢、抑制炎症反应等作用,PPARγ介导的信号能负反馈调节T细胞、巨噬细胞及有关免疫调节细胞的活化、增生及炎症反应基因的转录,因而在抑制肺间质组织局部炎症和纤维化中可能发挥重要作用。
一次性大剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射建立1型糖尿病大鼠模型,给予人工发酵虫草菌丝体干粉和罗格列酮进行干预,并应用HE染色、Masson染色、免疫组织化学法、RT-PCR等方法观察肺组织形态的改变和AGEs,TGF-β1,MMP-9和TIMP-1在肺组织表达的情况,探讨AGEs,TGF-β1,MMP-9和TIMP-1在糖尿病肺纤维化病变过程中的作用和人工发酵虫草菌丝体干粉及罗格列酮对肺脏的保护作用。
方法:
将60只8周龄雄性SD大鼠分为正常对照组和实验组,随机抽取其中的15只大鼠作为正常对照组(A组),剩余的45只则作为实验组。对实验组大鼠进行链脲佐菌素腹腔注射(55mg/kg),72小时后取尾静脉血测定血糖大于16.7mmol/L,并持续3天,为1型糖尿病大鼠模型造模成功。将45只糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组(B组)、人工发酵虫草菌丝体干粉(2.4g/kg/d)干预组(C组),罗格列酮(4mg/kg/d)干预组(D组)。实验共持续12周,在造模前及成膜后0、4、8、12周末测定大鼠血糖、体重和12周末24小时尿量;于第12周末股动脉放血处死动物,取出糖尿病大鼠双侧肺脏,右侧肺组织制备光镜切片,运用HE,Masson染色观察肺脏形态学改变及胶原纤维分布情况;应用免疫组化方法检测AGEs,TGF-β1在肺组织的表达部位及水平;左侧肺组织应用RT-PCR方法检测MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA的表达情况。使用SPSS13.0统计软件处理实验结果,符合正态分布且方差齐性的数据,多组间比较采用方差分析,组间比较采用LSD检验。
结果:
1：造模72小时候后,实验第4周、8周和12周末,B、C和D组较A组大鼠血糖明显升高,差异具有统计学意义(P均＜0.01)。实验第4周、8周和12周末,B、C和D组较A组大鼠体重明显降低,差异具有统计学意义(P均＜0.01)。
2：HE、Masson染色结果显示,与A组相比,B组可见肺泡壁增厚,肺泡间隔明显增宽,大量炎细胞浸润,肺间质中成纤维细胞明显增多,胶原纤维沉积,肺泡结构破坏,部分肺泡腔出现萎缩、塌陷;一些肺泡毛细血管出现缩窄、扭曲甚至闭塞。C组和D组较B组有所改善。
3：免疫组化分析结果显示,与A组比较,B、C和D组AGEs,TGF-β1表达明显升高,差异具有显著性(P均＜0.01);与B组比较,C组和D组表达水平有所降低,差异具有显著性(P均＜0.01)。
4：RT-PCR反应结果显示,B、C和D组MMP-9 mRNA表达较A组降低,TIMP-1 mRNA表达较A组升高(P均＜0.01);C组和D组MMP-9 mRNA表达较B组上调,TIMP-1 mRNA表达较B组降低,且差异具有显著性(P均＜0.01)。
结论:
1：一次性腹腔注射大剂量STZ,破坏大鼠胰岛β细胞,可建立以血糖升高、尿量增加、体重下降为特征的1型糖尿病大鼠模型。此模型与人类1型糖尿病特征类似。
2：糖尿病大鼠肺组织形态结构改变符合肺纤维化的病理变化,肺组织AGEs,TGF-β1,MMP-9和TIMP-1表达水平异常,提示其可能参与了糖尿病肺纤维化的发生和发展。
3：糖尿病大鼠经人工发酵虫草菌丝体干粉和罗格列酮干预治疗后,明显改善了肺组织的病理形态,其机制可能是调节了肺组织AGEs,TGF-β1,MMP-9和TIMP-1的表达水平,从而发挥了明显的肺脏保护作用。