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研究背景及目的结直肠癌是最常见的消化道肿瘤之一,是导致癌症死亡的第三大原因。该病通常是以良性腺瘤性息肉起病,逐渐发展为腺瘤伴高度不典型增生,最终进展为浸润性癌。尽管早期通过手术及术后化疗可以有效地治疗结直肠癌,但患者的高复发率和转移率仍给结直肠癌的治疗带来了巨大的挑战。结直肠癌有着复杂的分子病理学基础,多种基因、多类分子、多条通路相互作用,使得肿瘤转移的机制更为复杂。如果能够发现多条促肿瘤转移通路中的共激活因子,将会为结直肠癌转移的机制研究及靶向治疗带来巨大的进步。Hippo信号通路在调节组织稳态、细胞增殖、细胞凋亡及干细胞功能中发挥着重要的作用。YAP是Hippo信号通路下游的重要效应分子,是多种癌症的转录共激活因子。因此,YAP的表达异常会导致Hippo信号通路的功能紊乱,有助于癌症的发生和发展。上皮-间质转化使肿瘤细胞失去细胞极性,发生形态改变,并增加细胞及细胞基质间的相互作用,从而更易于细胞脱离原发灶,具有更强的侵袭和转移能力。有研究表明上皮-间质转化在肿瘤转移过程中发挥着重要的作用,如果YAP参与调控上皮-间质转化的过程,成为上皮-间质转化的关键“开关”,将会为防止肿瘤转移带来新的治疗靶点。本实验旨在研究YAP在结肠癌组织中的表达水平,分析YAP的表达与结肠癌临床病理因素的关系,探讨其表达对患者预后的影响;同时我们还将研究结肠癌原发灶及其多器官转移灶中YAP及EMT标志物表达水平的差异及相关性;并进一步探究YAP调控结肠癌迁移、侵袭及上皮-间质转化的作用及机制,为防止肿瘤转移提供新的思路。第一部分YAP在结肠癌组织中的表达及其与上皮-间质转化的相关性研究目的:以体内组织为研究对象,研究YAP在结肠癌组织及其配对癌旁组织、结肠癌原发灶及其配对转移灶中的表达水平;探究结肠癌原发灶及其多器官转移灶中YAP及EMT标志物表达水平的差异及相关性;分析YAP的表达与结肠癌临床病理因素的关系,探讨其表达对患者预后的影响。研究方法:1、收集符合纳入条件的80例结肠癌原发灶及24例多器官转移灶的组织蜡块,通过组织免疫荧光染色和免疫组织化学法定位及半定量YAP、磷酸化YAP和N-钙粘蛋白在不同组织内的表达情况;分析不同组织内YAP的表达与上皮-间质转化的相关性;探讨YAP的表达与结肠癌临床病理特征及患者预后的关系。2、应用GEO数据库信息,根据不同的组织配对要求(癌与癌旁、原发灶与转移灶)选择合适的数据集,并下载其内芯片寡核苷酸微阵列数据,定量分析YAP在不同组织内的mRNA表达情况;在GEO数据库中筛选出具有大样本量、包含完整预后信息的结肠癌数据集,下载高通量数据样本中患者的预后资料,分析和验证YAP高表达对患者预后的影响。结果:1、结肠癌组织中YAP的mRNA及蛋白表达量高于正常结肠组织。2、结肠癌原发灶和转移灶组织中YAP的阳性表达率分别为80.00%和87.50%,N-钙粘蛋白阳性表达率分别为61.25%和37.50%。N-钙粘蛋白在结肠癌原发灶组织中的阳性表达率高于结肠癌转移灶组织,差异有统计学意义(p<0.05)。而YAP在结肠癌转移灶组织中的阳性表达率高于结肠癌原发灶组织,差异无统计学意义(P>0.05)。3、在结肠癌原发灶组织中,有47个样本出现YAP与N-钙粘蛋白的共同表达,占所有病例的58.75%;在结肠癌转移灶组织中,仅8个样本出现YAP与N-钙粘蛋白的共同表达,占所有病例的33.33%。YAP与N-钙粘蛋白的表达仅在结肠癌原发灶中呈正相关(r=0.5003,p<0.05),在结肠癌转移灶中两者的表达没有相关性(r=0.0325,p>0.05)。4、YAP及N-钙粘蛋白的阳性表达与肿瘤的浸润深度及远处转移有关(p<0.0.5),而与肿瘤发生部位、大体形态、组织学类型、分化程度、大小、淋巴结转移及脉管内癌栓无关(p>0.05)。5、YAP高表达患者的总生存时间较YAP低表达或不表达的患者明显缩短。结论:1、YAP在结肠癌组织中的表达明显高于正常组织,可作为鉴别手术切缘干净与否的一种判断标准。2、YAP的阳性表达与肿瘤浸润深度及远处转移有关,YAP高表达的肿瘤局部侵袭性更强,更容易发生转移。这说明YAP与肿瘤的转移机制,尤其是转移早期阶段有关,可作为提示肿瘤诊疗观察的方向。3、YAP高表达患者的总生存期较短,提示YAP可作为考量患者预后情况的因素之一。4、YAP在肿瘤原发灶中可以通过调控上皮-间质转化,促进肿瘤转移的发生。第二部分YAP在结肠癌侵袭、迁移及上皮-间质转化中的作用研究目的:以体外培养的细胞系为研究对象,研究YAP在结肠癌侵袭、迁移及上皮-间质转化中的作用及机制。研究方法:1、选取6种常见的结肠癌细胞系(SW480、SW620、SW1116、DLD-1、HT29和HCT116),分别提取总RNA、细胞总蛋白、胞核蛋白及胞浆蛋白;使用qRT-PCR及Western Blotting检测YAP、p-YAP(Ser127)、E-钙粘蛋白及N-钙粘蛋白的表达水平;观察具有不同细胞形态(鹅卵石样、纺锤体样)及临床Dukes分期的细胞中YAP及EMT相关标记物的表达是否有差异;筛选YAP表达较高的细胞系用于后续实验。2、结肠癌细胞系SW480及SW620分别感染“干扰YAP表达”的SiYAP和“使YAP过表达”的LV-YAP慢病毒载体;筛选出稳定感染的细胞;使用qRT-PCR及Western Blotting检测慢病毒感染后YAP的表达情况;利用Transwell细胞迁移及肿瘤侵袭实验检测YAP表达升高或降低对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。3、Western Blotting检测YAP表达升高或降低对EMT相关分子标志物及MMP2的影响。结果:1、6种结肠癌细胞系均有YAP的表达,其中HCT116的总YAP表达水平最低,其余细胞系的YAP表达量没有显著差异。鹅卵石样细胞及纺锤体样细胞的总YAP表达差异不明显。不同临床Dukes分期的细胞,其总YAP表达量没有显著差异。2、LV-YAP过表达慢病毒载体感染细胞后可以有效增加YAP的表达量,SiRNA干扰慢病毒载体感染细胞后则可以有效减少YAP的表达量;干扰YAP表达可以抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭能力,反之,增加YAP的表达可以促进结肠癌细胞的迁移及侵袭。3、干扰YAP表达可以使N-钙粘蛋白、波形蛋白、snai1及MMP2表达水平减低,E-钙粘蛋白表达水平升高,反之,增加YAP的表达量可以降低E-钙粘蛋白表达而升高N-钙粘蛋白、波形蛋白、snai1及MMP2的表达。结论:1、YAP的高表达是肿瘤细胞易发生侵袭及转移的基本表现之一。2、抑制YAP的表达可以妨碍肿瘤细胞的侵袭和转移,是控制肿瘤转移的有效途径。3、YAP可以通过调节上皮-间质转化,促进结肠癌细胞的迁移及侵袭能力。4、深入研究YAP的作用机制,可以寻找到控制肿瘤转移发生的治疗药物。