论文部分内容阅读
背景和目的:我国当前HIV-1亚型种类多样,且主要流行亚型CRFO1 AE、CRF07 BC以及B亚型中发现多种亚簇的存在,提示我国HIV-1基因日趋多样进化。HIV-1基因进化多样性的研究不仅能够了解感染者病毒的种类和来源,与相关流行病学信息结合可以为探索不同传播途径和不同基因特点的HIV-1防治措施提供思路,进而降低HIV-1传播给未感染者的概率。本论文通过开展三项研究,分别观察:1、我国广西部分地区未治疗的16-25岁HIV-1阳性人群CRFO1_AE亚型毒株基因亚簇的特点、相互之间传播关系以及系统进化特征;2、全国15个省/市MSM人群感染HIV-1B亚型毒株亚簇的种类、特征、传播关系以及起源时间;3、建立基于Illumina二代测序技术的实验和分析方法,探讨北京市MSM人群HIV-1基因准种以及影响准种形成的因素。方法:本研究采用横断面调查:1、在我国HIV-1流行相对严重的广西壮族自治区的贺州市、柳州市和南宁市三地区16-25岁的近似认为新近感染HIV-1的患者开展调查,扩增得到其pol基因区(2253-3392bp)序列,利用最大似然法(MaximumLikelihood)对发现的CRF01_AE亚型进行系统进化分析。2、收集2007-2014年间来自15个省/市MSM人群的354条HIV-1 B亚型pol基因区序列。利用最大似然法确定中国MSM人群中的pol基因区B亚型的基因特点和变化,并使用贝叶斯(Bayesian)合并理论分析B亚型毒株的近全长基因,估算物种的起源时间。3、基于Illumina的二代测序平台,设计加有index标签的特异性引物,分别扩增两段pol基因区和一段env基因区,应用全新的数据分析方案,最终建立一种能检测HIV-1准种的实验方法和数据分析方案。收集研究对象的流行病学及临床相关资料包括基本人口学、行为学信息,及CD4+淋巴细胞计数、病毒载量(VL)等实验室检测的指标。使用SAS 9.2软件完成统计学分析,所有的统计检验采用双侧检验,P<0.05统计学有意义。结果:1、在累计收集的2009-2013年广西贺州、柳州和南宁三地区16-25岁人群的260份HIV-1阳性样本中,最终获得CRFO1_AE亚型的pol基因区序列分别为36、147和33条。83.3%(180/216)的样本报告为经异性性接触途径感染。基于系统进化树分析,发现213(98.6%)条序列聚集为5个比较大的流行簇。贺州地区,HIV-1CRFO1_AE亚型有88.9%(32/36)为cluster 2,11.1%(4/36)为cluster 1。柳州地区,CRFO1_AE亚型主要为cluster 1(83.0%,122/147),另有11.6%(17/147)的cluster 2、1.4%(2/147)的cluster 3.2.7%(4/147)的cluster 4以及0.7%(1/147)的cluster 5。而南宁地区流行簇分布多种多样,有18.2%(6/33)的cluster 1、27.3%(9/33)的cluster 2.18.2%(6/33)的cluster 3.12.1%(4/33)的cluster 4和9.1%(3/33)的cluster 5。2、基于pol基因区的B亚型样本的系统进化分析显示,在我国MSM人群中共存在12个(定义为clusterl-12)不同的进化簇(93.8%,332/354)。值得注意的是,研究序列的57.3%(203/354)构成一个主要的流行进化簇(定义为cluster 1),并且cluster 1中的74.4%(151/203)为来自北京的序列,14.0%(28/203)为来自上海的序列,另外还有2.9%(6/203)的河北序列和8.9%(18/203)的来自于中国其他地区的序列。通过ML系统进化树分析发现,cluster 1的序列主要与中国北京的参考序列聚在一起。选择cluster 1根部的三条序列进行近全长基因序列的扩增(9300 bp),利用贝叶斯合并理论,对B亚型毒株内部各流行簇的tMRCA进行了估算,cluster 1的流行起始时间为1981年(95%HPD,1977-1985),分别早于B’t、流行簇的1988年、B’YY流行簇的1984年和B’流行簇的1982年。3、以北京MSM阳性未治疗样本为研究对象,使用Illumina公司的MISeq测序仪进行二代测序,最终得到env基因区和至少一段pol基因区的二代测序的样本量为377份(90.6%,377/416)。平均深度为 12726.80(3429.861,22023.739)条,其中81.7%(308/377)的样本在片段内以及片段间为单一亚型,18.3%(69/377)样本的pol基因区和env基因区亚型不一致。结合社会人口学及行为学信息分析发现,影响该人群HIV准种复杂度的主要原因是亚硝酸盐类新型毒品的使用,饮酒等行为的增加,从而导致多性伴,临时性行为以及无保护性行为的增加。在所有得到的序列样本中,重组率和超感染率分别为9.01%(34/377)和9.28%(35/377),其中亚型内重组率为2.12%(8/377),亚型间重组率为6.90%(26/377),亚型内超感染率为1.32%(5/377),亚型间超感染率为7.96%(30/377)。结论:1、广西省壮族自治区中各个地区CRFO1_AE毒株来源不同且有明显的地区性流行特点。贺州主要是cluster 2,柳州主要是cluster 1,而南宁则呈现出多种簇均衡存在的特点,这可能与南宁作为省会城市聚集了各地的感染者,流行形式较复杂有关。故针对各地区不同HIV-1流行形式需要针对性的防控策略,才能有效遏制传播的扩散。2、中国MSM感染HIV-1B亚型毒株的人群中发现12簇不同的流行簇,基因变异高于CRFO1_AE亚型。Cluster 1为主要流行亚簇,可能为北京地区MSM最初感染的B毒株在地域范围内进化后广泛流行;通过近全长序列分析,cluster 1中序列没有发现明显的重组断点,且其流行起始时间长、感染时间早。3、本研究建立起一种基于Illumina的二代测序平台的能检测HIV-1亚型和亚簇重组以及超感染的实验方法和分析方法,首次量化分析了 MSM患者中的基因复杂程度,获得了北京HIV-1阳性MSM人群高达9.28%超感染的数据。