肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种中年起病的神经系统变性疾病,大部分患者在诊断后的3-5年内死于呼吸衰竭。该病选择性地损伤大脑皮层、脑干及脊髓的运动神经元,从而导致临床表现为肌肉萎缩以及肌肉无力。尽管约90%为散发病例,铜/锌超氧化物歧化酶1(Cu2+/Zn2+superoxide dismutase,SOD1)基因突变仍是最为熟知的家族性肌萎缩侧索硬化的病因,并且携带人类突变的SOD1-G93A基因的小鼠已经被普遍地应用于肌萎缩侧索硬化治疗及病因探索上来。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)一直以来作为生理及病理情况下血管生成的重要因素而广泛研究,近年来许多研究证实其对运动神经元存在确定的保护作用,其在ALS中的重要作用也引起了广泛关注。许多不同的载体及给药途径被用于转运VEGF至中枢神经系统。Azzouz等人应用慢病毒作为载体通过肌肉注射的方式将VEGF转运至神经元,并发现该方法可以有效地延长ALS鼠的生存期。也有研究通过侧脑室注射(Intracerebroventricular,ICV)的方式将VEGF蛋白或者是以腺相关病毒血清4型(Adeno-associated virus 4,AAV4)为载体的VEGF基因转运至中枢神经系统。另外也有研究通过鞘内注射的方式将过表达VEGF的神经干细胞移植至SOD1-G93A转基因小鼠。这些不同的给药方式均可以延长ALS小鼠的生存期。然而,我们希望进一步提高VEGF的转导效率,寻找更有效的给药途径和方式。已有研究表明以巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)为启动子的AAV9载体于脊髓的运动神经元中表达最强,而鞘内注射虽然为有创操作,但是其具有用量小,脱靶效应小的优点,因此本研究中我们构建以CMV为启动子的AAV9载体通过鞘内注射的方式来转运VEGF,从而提高其转染效率,进而观察VEGF对ALS小鼠生存期的影响。ALS的发病机制尚不清楚,许多复杂的分子及细胞水平机制都可以导致运动神经元变性。尽管多数研究都将关注点放在了运动神经元损伤,近年来许多研究发现非神经元细胞也参与其发病机理并影响疾病的病情进展。这种非细胞自身的毒性对运动神经元的死亡至关重要。小胶质细胞作为中枢神经系统重要的固有免疫细胞是加速疾病进展的重要因素,并且在炎症反应过程中也发挥着重要的作用。有研究发现选择性地抑制ALS小鼠小胶质细胞中的重要的炎症调控因子NF-k B可以明显的减少运动神经元的死亡。而活化的小胶质细胞又可以根据刺激因子及周围环境的不同分为经典活化型(M1型)与选择活化型(M2)两种分型。在疾病早期,起到神经保护作用的M2型小胶质细胞为主,而随着疾病进展在疾病快速进展期,由于许多细胞因子如肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1(Interleukin-1,IL-1)、γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)等的产生,小胶质细胞逐渐以促炎的M1型为主。因此,本研究在以往VEGF作用机制研究的基础上,进一步探索其对ALS小鼠小胶质细胞增生及神经炎症的作用,以求进一步了解VEGF对神经元的保护作用机制。第一部分鞘内注射scAAV9-VEGF-165对ALS小鼠生存期及行为学的影响目的:验证改良后的鞘内注射方式是否可以在中枢神经系统有效地表达目的基因;构建以CMV为启动子的携带VEGF-165治疗基因的scAAV9载体,并通过改良简化的鞘内注射方式干预90天的雌性及雄性ALS小鼠,观察ALS小鼠生存期及行为学的改变。方法:1构建以CMV为启动子的scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP病毒载体,经纯化透析后,通过PCR技术验证病毒滴度。2我们选取美国Jackson实验室的SOD1G93A小鼠为动物模型,并在恒定温度、恒定湿度且无特殊病原菌的动物房中饲养、繁殖。改良的简化鞘内注射方式:小鼠经水合氯醛麻醉后,用透气纱布覆盖小鼠头部及躯干上部,并用拇指及食指固定小鼠髂骨部位,减去腰部毛发暴露中线位置。酒精消毒皮肤后,用汉密尔顿微量注射器在髂骨中线部位以70-80°进针,感受到脊柱骨面后将进针角度减少至30°并尝试滑入椎间隙(L5-6)。小鼠出现侧向甩尾或是尾巴呈现“S”形可以作为进入蛛网膜下腔的标记。3小鼠经简化的鞘内注射方式给予scAAV9-GFP(1 x 109 vg/g)干预三周后,分别将小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材或直接新鲜取材,通过免疫荧光及蛋白印迹技术观察绿色荧光蛋白的表达及分布特点,验证改良的鞘内注射方式是否可以有效的在中枢神经系统表达目的基因蛋白。4采用简化的鞘内注射方式分别干预90天雌性及雄性的ALS小鼠。将同窝的、体重相近的90天雌性及雄性的ALS小鼠随机的分为两组,通过简化的鞘内注射方式按体重分别给予scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP(1μl/g),每组各15只。观察给药组及对照组的生存期并记录其体重,同时通过脚印分析、转轮及神经功能评分来评估ALS小鼠的运动功能,从而观察VEGF对ALS小鼠的治疗作用。结果:1构建的scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP载体经PCR检测病毒滴度为1×1012 vg/ml;2鞘内注射scAAV9-GFP三周后,免疫荧光结果显示绿色荧光蛋白主要在脊髓前角表达,并可以与Neu N标记的神经元共定位。免疫印迹结果表明,通过我们改良后的简易的鞘内注射方式给予scAAV9-GFP后,绿色荧光蛋白可以在中枢神经系统广泛表达,包括脊髓、小脑、皮层,并且以脊髓分布为主;3经scAAV9-VEGF-165鞘内注射干预的雌性ALS小鼠较对照组生存期延长13天(P﹤0.01),雄性小鼠生存期延长12天(P﹤0.01),雌性、雄性之间的天数区别没有统计学差异。在早期,GFP对照组小鼠的体重相较于VEGF给药组小鼠偏低,但是这种差别并没有统计学意义,直到121天(雌鼠)和129天(雄鼠)时,GFP对照组小鼠的体重与VEGF-165给药组小鼠的体重差异才存在统计学差异。脚印分析表明在小鼠110天时,对照组表现出更明显的步态异常以及步长变短的情况。在转轮实验中,VEGF-165给药组雌、雄小鼠的表现均较对照组好。同时,给予VEGF-165后可以延缓小鼠神经功能评分的降低。另外,我们通过对小鼠腓肠肌的HE染色发现,GFP对照组小鼠肌肉萎缩更加明显,HE染色可见角型萎缩及核中心移位。第二部分鞘内注射VEGF通过其抗凋亡作用保护运动神经元目的:观察鞘内注射scAAV9-VEGF-165后的ALS小鼠较对照组脊髓运动神经元数目及形态的变化,并对其神经保护机制进行研究。方法:1我们选取美国Jackson实验室的SOD1G93A小鼠为动物模型,并在恒定温度、恒定湿度且无特殊病原菌的动物房中饲养、繁殖。随机将6组90天ALS小鼠给予鞘内注射scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP,3周后分别将小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材(3组)或直接新鲜取材(3组)。2通过免疫组化染色计数VEGF-165给药组及GFP对照组SMI-32阳性细胞数,并观察VEGF-165给药组及GFP对照组运动神经元形态变化。3通过原位末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP end-labeling,TUNEL)检测VEGF-165给药组及GFP对照组小鼠腰髓细胞凋亡情况,并进一步通过免疫印迹技术检测VEGF-165给药组及GFP对照组小鼠PI3K/Akt信号通路的改变及抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的水平变化。结果:1免疫组化结果显示110天取材的VEGF-165治疗组小鼠的腰髓SMI-32阳性细胞数较GFP对照组小鼠明显保留(8.8±1.96个/层vs.6.2±1.3个/层,P﹤0.05),且运动神经元形态更加完整;2TUNEL检测结果表明VEGF-165治疗组小鼠腰髓TUNEL阳性的细胞数较对照组明显减少(24.8±8.2%vs.44.5±14.4%,P﹤0.05);3给予scAAV9-VEGF-165鞘内注射3周后,小鼠腰髓VEGF-165水平明显升高约2倍,通过免疫印迹技术检测发现VEGF-165治疗组小鼠脊髓PI3K/Akt信号通路激活,PI3K/Akt水平较对照组升高,且活化的caspase-9及caspase-3水平降低(P﹤0.05)。同时,与GFP对照组相对比,VEGF-165治疗组小鼠的脊髓中抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高而促凋亡蛋白Bax水平下降(P﹤0.05)。第三部分VEGF治疗减少ALS小鼠脊髓胶质细胞增生并调节小胶质细胞分化目的:观察鞘内注射scAAV9-VEGF-165后的ALS小鼠较对照组脊髓小胶质细胞及星形胶质细胞数目及形态的变化,并探讨VEGF对小胶质细胞分型及神经炎症的影响。方法:1我们选取美国Jackson实验室的SOD1G93A小鼠为动物模型,并在恒定温度、恒定湿度且无特殊病原菌的动物房中饲养、繁殖。随机将6组90天ALS小鼠给予鞘内注射scAAV9-VEGF-165及scAAV9-GFP,3周后分别将小鼠用冰的4%多聚甲醛灌注取材(3组)或直接新鲜取材(3组)。2通过免疫组化染色计数VEGF-165给药组及GFP对照组GFAP及Iba1阳性细胞数,并观察VEGF-165给药组及GFP对照组星形胶质细胞及小胶质细胞形态变化,另外通过免疫印迹技术观察VEGF治疗组小鼠及对照组小鼠脊髓CD11b及GFAP水平的差异。3通过免疫荧光技术观察VEGF治疗组、GFP对照组ALS小鼠及阴性对照鼠脊髓CD68的表达及其与Iba1共定位的情况,另外通过PCR技术分析研究VEGF治疗组、GFP对照组ALS小鼠及阴性对照鼠脊髓中CD68、TNF-α、IL-1β、Arginase-1以及Ym-1m RNA水平的差异,并通过免疫印迹技术观察VEGF治疗组、GFP对照组ALS小鼠及阴性对照鼠脊髓中CD68、TNF-α、Arginase-1及转化生长因子(Transforming growth factor beta,TGF-β)蛋白水平的差异。结果:1免疫组化结果显示110天取材的GFP对照组小鼠的腰髓GFAP(311±46个/层vs.163±17.61个/层,P﹤0.05)及Iba1阳性细胞数(383±19.15个/层vs.218.3±28.02个/层,P﹤0.05)较VEGF治疗组小鼠增生明显,且胶质细胞形态更为肥大。免疫印迹结果表明VEGF治疗组小鼠较GFP对照组小鼠脊髓中CD11b及GFAP蛋白水平明显降低(P﹤0.05),与免疫组化结果一致;2免疫荧光结果表明阴性小鼠脊髓CD68阳性细胞数很少,而GFP对照组ALS小鼠CD68阳性细胞数明显增多,而给予VEGF治疗后CD68阳性细胞数明显减少,同时CD68阳性细胞可以与Iba1标记的小胶质细胞共标记;3PCR结果表明给予VEGF治疗后的ALS小鼠脊髓中M1型小胶质细胞标记物(CD68、TNF-α、IL-1β)的水平较对照组降低(P﹤0.05),而M2型小胶质细胞标记物(Arginase-1及Ym-1)的水平有所升高(P﹤0.05);4免疫印迹结果显示与PCR结果一致,即VEGF治疗后可以提高ALS小鼠脊髓中Arginase-1的水平,并减少CD68、TNF-α蛋白的表达,同时可以使TGF-β水平升高,而TGF-β可以促进小胶质细胞转化为M2型。结论:1本研究采用了改良后简化的鞘内注射手法干预小鼠,并构建了以CMV为启动子的scAAV9病毒载体,通过该方法给予scAAV9-GFP后,发现目的蛋白可以在中枢神经系统广泛表达,并主要表达于脊髓前角运动神经元,从而证实该方法的可操作性,为下一步进行VEGF干预治疗提供依据。2与以往研究结论一致,我们采用改良后的鞘内注射方式给予ALS小鼠scAAV9-VEGF治疗后,雌性及雄性小鼠生存期均较对照组延长,且运动功能明显改善,进一步肯定了VEGF对ALS的治疗作用。3VEGF治疗后ALS小鼠脊髓神经元得以保留,我们进一步证实了其神经保护作用得益于PI3K/Akt信号通路的激活,促凋亡蛋白水平降低而抗凋亡蛋白水平升高。4小胶质细胞增生在ALS发病过程中发挥重要作用,我们研究得出VEGF治疗后可以有效减少ALS小鼠脊髓胶质细胞增生,并能调节小胶质细胞分型。