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大环内酯类药物具有广谱抗菌活性,而且还具有免疫调节、抗肿瘤、抗虫和抑制炎症因子产生等作用,是人医临床上广泛使用的一线抗生素。但随着大环内酯类抗生素的广泛应用,大环内酯耐药问题日趋严重。据文献报导,大环内酯高水平耐药机制主要由核糖体甲基转移酶(adenine-specific N-methyltransferase,methylase)介导,而这类核糖体甲基转移酶由erm(erythromycin ribosome methylase)基因家族编码。研究认为,Erm甲基转移酶通过修饰大环内酯类药物作用靶位23S核糖体RNA(rRNA)的A2058,使其发生单甲基化或双甲基化,产生空间位阻,降低23S rRNA与大环内酯类药物的亲和力,从而产生耐药。本实验室前期研究发现,解没食子酸链球菌巴氏亚种(Streptococcus.gallolyticus subsp.pasteurianus)中ermB、ermT基因共同诱导大环内酯高水平耐药,且二者上游均有启动子和前导肽,但上游启动子与前导肽序列对下游erm基因的表达调控机制及与大环内酯耐药的关系并不清楚。本研究旨在探讨ermB、ermT基因上游前导肽及启动子序列对二者表达调控的机制,为大环内酯增效剂的研制提供理论依据。研究结果如下:1.ermB、ermT表达载体的构建与纯化及多克隆抗体制备将ermB、ermT基因分别构建至pET28a载体,利用亲和层析纯化出ErmB、ErmT蛋白,与蛋白存储液1:1混合,ErmB、ErmT蛋白浓度均调整为1 mg/m L,分装,-80℃保存。将纯化的ErmB、ErmT蛋白作为抗原,与弗氏佐剂1:1混合,通过皮下注射方式免疫六周龄雌性BALB/c小鼠,经过四次免疫之后,眼球采血,制备血清。纯化浓缩后的血清作为制备的鼠源多克隆抗体,用于后续Western Blot检测ErmB与ErmT蛋白的表达。2.前导肽对ermB、ermT基因的表达调控及MIC值测定取冻存的ermB、ermT及含有上游前导肽序列的克隆ermBL与ermTL菌液接种于液体LB培养基中,并用终浓度为32μg/m L红霉素诱导,37℃180 rpm摇床培养过夜。收集菌体,提取总RNA、总蛋白,分别用qPCR、Western Blot检测ermB、ermT基因的表达;同时用微量稀释法,对ermB、ermT及ermBL与ermTL菌株进行MIC值检测。结果表明,在m RNA、蛋白水平,相对于无前导肽的ermB、ermT菌株而言,前导肽负调控ermB、ermT基因的表达,并且ermB、ermT基因上游的前导肽使其MIC值减半。3.前导肽突变体构建结合实验室前期已构建至pET28a载体的ermBL、ermTL,分别对ermBL、ermTL前导肽首位甲硫氨酸之后的前10个氨基酸进行丙氨酸取代突变,共构建了20个突变体。4.红霉素诱导突变体中ermB、ermT基因的表达及MIC值检测取冻存的20株前导肽突变体菌液接种于液体LB培养基中,并用终浓度为32μg/m L红霉素诱导,37℃180 rpm摇床培养过夜。收集菌体,提取总RNA、总蛋白,分别用qPCR、Western Blot检测ermB、ermT基因的表达;同时用微量稀释法,对前导肽突变体进行MIC值检测。结果显示构建的10株ermBL突变体中,L2A、N8A、V9A、D10A和K11A这5株突变体ermB基因的表达与菌株耐药性成正相关,即ermB基因的表达越高,细菌红霉素耐药性越强;而在构建的另10株ermTL突变体中,其中S5A、F7A、N10A,这3株突变菌株ermT基因的表达与菌株耐药性成正相关,即ermT基因的表达越高,细菌红霉素耐药性越强。这些结果证实,相对于无前导肽的ermB、ermT菌株而言,ermB与ermT基因上游的前导肽序列负调控下游ermB与ermT基因的表达;ermB基因上游前导肽中L2、N8、V9、D10和K11对负调控ermB基因表达重要;而ermT基因上游前导肽中S5、F7和N10对负调控ermT基因表达重要。5.启动子载体构建在实验室前期研究中,发现六株解没食子酸链球菌巴氏亚种的前导肽编码序列上游有两种不同的野生型启动子序列,序列为TTTGCA…….TATAAT(简称G型)和TTTACA…….TATAAT(简称A型)。将G型和A型启动子分别构建至ermBL、ermTL上游,分别命名为G-ermBL、A-ermBL、G-ermTL和A-ermTL。6.启动子对ermBL、ermTL的表达调控及MIC值检测取构建好的4株启动子重组质粒菌液接种于液体LB培养基中,并用终浓度为32μg/m L红霉素诱导。收集菌体,提取总RNA、总蛋白,分别用qPCR、Western Blot检测ermB、ermT基因的表达。同时用微量稀释法,对4种启动子重组质粒进行MIC值检测。结果显示,G型启动子和A型启动子均促进ermB与ermT基因的表达,导致的细菌对红霉素高水平耐药;且G型启动子和A型启动子重组质粒的MIC值高于野生型ermBL、ermTL,表明启动子促进下游耐药基因表达,导致细菌对红霉素耐药性增强。结论:相对于无前导肽的ermB、ermT菌株而言,前导肽负调控ermB、ermT基因的表达并使其MIC值减半,说明前导肽降低对大环内酯类药物的耐药性;ermBL突变体中L2A、N8A、V9A、D10A、K11A突变导致ermB基因表达增加;ermTL突变体中S5A、F7A、N10A突变导致ermT基因表达增加,这些氨基酸残基突变使大环内酯耐药水平增加;上述结果说明ermB前导肽序列中L2、N8、V9、D10和K11对负调控ermB基因表达重要;而ermT基因上游前导肽中S5、F7和N10对负调控ermT基因表达重要。G型和A型启动子均促进ermB、ermT基因表达,增强大环内酯耐药。本研究揭示了前导肽和启动子序列对大环内酯耐药基因ermB和ermT的表达调控机制,为大环内酯抗菌增效剂的研发奠定了理论基础并提供了新的方向。