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本研究在优化尖顶羊肚菌多糖的提取纯化方案基础上,以体外细胞培养的方法研究尖顶羊肚菌胞外多糖(EPMC)和胞内多糖(IPMC)对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌一氧化氮(NO)的影响,并从细胞信号通路的角度探讨其影响机制。本研究的结果将为羊肚菌药用功效的作用机制研究及食药用真菌活性提取物调控细胞NO分泌的机理模型构建提供理论基础,并为以羊肚菌及其活性提取物为主要成分的药品和功能产品开发提供实验依据。具体研究方法和结果如下:
1.通过正交试验研究提取温度、提取时间、提取次数和料液比对尖顶羊肚菌菌丝体胞内粗多糖提取的影响,并通过验证实验得到最佳提取条件。结果表明,热水浸提尖顶羊肚菌胞内粗多糖的较佳提取条件为:提取温度为90℃,提取3h,提取3次,料液比为1:20。
2.使用DEAE-纤维素对尖顶羊肚菌胞外粗多糖和胞内粗多糖进行纯化。通过依次使用0.1,0.2,0.4mol/L NaCl溶液洗脱被吸附于DEAE-纤维素上的多糖,筛选了洗脱多糖效果较好的洗脱液浓度。结果表明,以0.1mol/L NaCl溶液为洗脱液能分别将两种多糖从DEAE-纤维素柱上较好的洗脱下来。洗脱后EPMC的得率为18.75％,它的总糖、还原糖和蛋白质含量分别为88.48％、10.84％和1.27％;IPMC的得率为45.38％,它的总糖、还原糖和蛋白质含量分别为75.19％、8.09％和0.51％。相对于纯化前,EPMC和IPMC的总糖含量分别提高了29.75％和8.86％,蛋白质含量分别降低了4.31％和1.78％,这说明使用DEAE-纤维素纯化尖顶羊肚菌多糖能够得到较好的纯化效果。
3.使用含有EPMC和IPMC的培养基培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,并使用MTT法检测细胞存活率,以确定EPMC和IPMC的安全浓度范围。结果表明,EPMC和IPMC在0-1600μg/ml的浓度范围内作用细胞24h,均不会对细胞的生长产生抑制作用,这说明巨噬细胞对EPMC和IPMC表现出良好的耐受能力。而且,浓度为400.1600μg/ml时,EPMC和IPMC会极显著促进细胞的增殖(P<0.01)。但是细胞数量增长过快容易引起细胞密度过大而不利于实验的进行和影响结果的准确性,宜将EPMC和IPMC的实验浓度范围选择在0—400μg/ml之间。
4.使用EPMC和IPMC分别与LPS共同作用于巨噬细胞,通过检测NO含量初步探索尖顶羊肚菌多糖对LPS诱导巨噬细胞分泌NO的影响。实验证明,EPMC和IPMC以50μg/ml的浓度作用细胞12h均可极显著抑制由LPS诱导的NO生成(P<0.01)。
5.先使用EPMC和IPMC预作用巨噬细胞,再使用LPS作用细胞,通过检测NO含量研究尖顶羊肚菌多糖的作用浓度和作用时间对LPS诱导巨噬细胞分泌NO的影响。实验结果表明,一定浓度的EPMC和IPMC作用巨噬细胞一定时间后均能极显著抑制LPS诱导的NO合成(P<0.01)；而且,相同作用浓度下,IPMC的作用效果要优于EPMC。当EPMC以100μg/ml的浓度,IPMC以25μg/ml的浓度作用细胞24h时,可完全抑制细胞内由LPS诱导的NO合成。浓度均为50μg/ml时,EPMC和IPMC的较佳作用时间均为12h。
6.使用ELISA和Western Blot技术检测受到EPMC和IPMC作用的细胞内多种信号分子的表达量,研究尖顶羊肚菌多糖抑制LPS诱导巨噬细胞分泌NO的信号机制。实验结果表明,100μg/ml的EPMC或25μg/ml的IPMC作用巨噬细胞一定时间后,能抑制细胞内由LPS诱导的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达及核因子-κB(NF-κB)与DNA结合,激活被LPS抑制的血红素合酶1(HO-1)的表达。使用HO-1抑制剂NaPP与EPMC或IPMC共同作用于巨噬细胞,被抑制的NO有一部分重新分泌,iNOS则重新表达,表明HO-1介导了EPMC和IPMC对LPS诱导NO分泌的抑制作用。此外,EPMC有效抑制了p38、C-jun N末端激酶(JNK)和丝裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)的磷酸化；但IPMC仅对JNK和MKK4的磷酸化起作用；它们均对NF-κ诱导激酶(NIK)的表达无显著抑制作用。EPMC和IPMC抑制LPS诱导巨噬细胞分泌NO的作用可能是它们对iNOS/NF-κB信号通路、HO-1/CO信号通路及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径进行信号调控的结果。而且两种多糖对巨噬细胞内信号通路的调控存在一定差异,这可能与它们的化学结构差异有关。