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目的(1)探讨异种脱蛋白松质骨理化与机械性能。(2)异种脱蛋白松质骨载体与自体MSCs的相容性以及对其生物学行为的影响。(3)探讨异种脱蛋白松质骨植入体内的免疫情况。(4)异种脱蛋白松质骨为载体构建组织工程骨在山羊脊柱横突间成骨融合观察。方法(1)取成年猪股骨远端松质部分,制为3cm×0.5cm×0.5cm大小骨条,其长轴与所取松质骨骨小梁排列方向一致,取材各骨块的表观孔隙密度基本相同。骨块1∶1氯仿甲醇液脱脂24小时,50℃蒸馏水震荡冲洗,20%H2O2浸渍24小时。反复3次。将处理后的骨块蒸馏水于室温下浸泡透析24小时,烘干。检测内容:处理液中羟脯氨酸的含量;扫描电镜观察大体形态结构;组织学观察;X线衍射分析无机成分的组成和晶体结构;氨基酸分析;生物力学性能研究。(2)抽取山羊髂骨骨髓5ml,梯度密度离心法分离提纯骨髓间充质干细胞,于含10%胎牛血清的DMEM液培养;细胞汇合至90%生长面积时消化传代,传至第二代时换含1×10-7mol/L地塞米松、1×10-2mol/Lβ-甘油磷酸钠、100mg/L维生素C的培养液进行成骨诱导;诱导分化后的细胞通过碱性磷酸酶染色进行鉴定。消化后计数,以2×106个/ml密度的MSCs细胞悬液复合载体材料培养,倒置相差显微镜下观察细胞贴附及基质分泌情况,检测ALP活性,流式细胞仪分析细胞周期、DNA倍体水平及细胞凋亡率。相同数量MSCs单纯培养板培养为对照组。(3)8只6-8月龄雄性青山羊,随机分为两组,实验组横突间植入异种脱蛋白松质骨,对照组为新鲜松质骨,术前24小时及术后3天、7天、14天、28天抽取外周血,流式细胞术检测CD3+、CD4+、CD8+和CD28+水平;术后28天取出植入材料,采用免疫组化方法检测抗原情况。(4)24只6-8月龄雄性青山羊,随机分为两组,制作脊柱3-4腰椎横突间植骨模型,采用Luque棒作内固定。实验根据不同植入物分为A、B、C、D四组。A组:异种脱蛋白松质骨复合一定数量的自体MSCs和骨形态发生蛋白(组织工程骨);B组:异种脱蛋白松质骨复合骨形态发生蛋白(BMP复合骨);C组:自体髂骨;D组:单纯异种脱蛋白松质骨。4、8、12周取材,X线、组织学和力学强度测定。结果(1)经脱蛋白处理的松质骨立体空间结构并无大的破坏,由羟基磷灰石和胶