论文部分内容阅读
为筛选肺鳞癌差异表达基因，结合本实验室前期构建的肺癌差异表达基因文库，我们制备了肺癌相关1.6K cDNA基因芯片。利用此芯片，我们比较了27例肺鳞癌组织和其自身癌旁肺组织之间的表达差异，获得了32个肺鳞癌相关高表达基因和19个肺鳞癌相关低表达基因；与文库信息的一致率分别为92％和79％。为验证筛选结果的可靠性，应用半定量逆转录PCR方法(RT-PCR)在同一套样品中进一步检测了芯片结果中的8个高表达基因；其中7个基因(CRKL、IGFBP5、SNRPG、SQLE、RAP2B、CLDN1、TBL1XR1)在肺鳞癌中的高表达得到了验证。RAP2B、CLDN1、TBL1XR1是筛选结果中定位于3q(肺鳞癌最显著的染色体高频扩增区域)的3个高表达基因，我们从RNA、蛋白、DNA水平对它们做了进一步研究。实时定量RT-PCR结果显示，相对于癌旁肺组织，RAP2B、CLDN1、TBL1XR1在肺鳞癌中的高表达率分别为64.3％(18／28)、82.1％(23／28)、75.0％(21／28)；Western blot结果表明CLDN1、TBL1XR1蛋白在肺鳞癌中的高表达率为85％(17／20)、53.3％(8／15)；应用实时定量PCR方法进一步发现CLDN1在56.2％(27／48)的非小细胞肺癌组织中存在DNA拷贝扩增。鉴于定制的肺癌相关1.6K cDNA基因芯片上的基因数目较少，我们又应用由英国肿瘤研究所提供的15K cDNA基因芯片，在11例肺鳞癌中进一步筛选了肺鳞癌相关差异表达基因。共获得380个肺鳞癌相关高表达基因和372个低表达基因。GO(Gene Ontology)分析结果显示，这些差异表达基因主要参与了细胞增殖、细胞周期、细胞分化、细胞粘附、DNA损伤及信号转导、血管发育、免疫反应等多个重要的、与肿瘤发生发展关系密切的生物学过程(P＜0.05)。从GO分析结果中，我们挑选了9个细胞周期相关的肺鳞癌高表达基因(BUB1、MAD2L1、KIF11、ORC6L、CDC2、CDKN3、CKS2、MYBL2、CHEK1)，应用实时定量RT-PCR方法在24对配对的肺鳞癌及其癌旁组织中进一步证实了它们在肺鳞癌中的高表达情况。我们的研究还发现，ORC6L和CKS2基因的表达与肺鳞癌的淋巴结转移情况相关；而BUB1和ORC6L基因的表达还与肺鳞癌患者的吸烟状况有关。进而，我们选用了商品化的安捷伦22K Oligo基因芯片(Agilent 22K Human 1AV2 Oligo Microarray，涵盖18，562个已知基因)全面鉴定了30例肺鳞癌的基因表达谱。通过比较发生淋巴结转移(19例)和未发生淋巴结转移(11例)的肺鳞癌的基因表达谱，发现有129个基因在这两组中有显著性的表达差异。将其中差异最显著的44个基因组合，能够准确区分这30例肺鳞癌的淋巴结转移情况。本项研究筛选鉴定的肺癌相关差别表达基因(群)将有助于深入了解肺癌发生发展的内在作用机制，为寻找肺癌诊断标志物以及发现新的肺癌治疗靶点提供线索。而应用安捷伦22K Oligo基因芯片进行的“肺鳞癌淋巴结转移预测特征谱”的初步研究，预期随着研究的进一步深入，将具有预测肺鳞癌患者复发转移风险、指导早期肺鳞癌患者接受适当的治疗方案的重要意义。