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目的:糖尿病周围神经病（Diabetic peripheral neuropathy,DPN）是糖尿病主要并发症之一,目前尚未有治疗该病的特效药物。施万细胞是包绕神经纤维的神经胶质细胞,参与髓鞘的形成。如果患有糖尿病后并发糖尿病周围神经病,施万细胞的自噬就会受到抑制。石蒜碱是从石蒜科植物中分离得到的一种生物碱,具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎等多种生物活性。据报道,石蒜碱（Lycorine）可以通过抑制Akt/mTOR通路来诱导细胞自噬,从而改善肝细胞癌病变。为了探究石蒜碱是否能够改善糖尿病施万细胞自噬,本研究采用糖尿病小鼠和体外培养的大鼠施万细胞系（RSC96）来明确石蒜碱对高糖条件下施万细胞自噬的影响。方法:1.足底痛觉测量仪、热板仪、电生理技术、透射电镜、免疫组织化学检测石蒜碱治疗对糖尿病小鼠坐骨神经结构与功能及自噬的影响30只6周大的雄性C57BL/6J小鼠,随机分为正常组（N,n=10）、糖尿病+生理盐水组（DM+Saline,n=10）、糖尿病+石蒜碱组（DM+Lycorine,n=10）。Ⅰ型糖尿病小鼠模型构建采用腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,150 mg/kg体重）的方式,单次注射3天后检测血糖≥16.7 mmol/L认为建模成功。建模成功后,糖尿病+石蒜碱组注射剂量为20 mg/kg体重的石蒜碱,糖尿病+生理盐水组注射等量的生理盐水,隔天注射一次,注射时间为21天,共计11次。在石蒜碱注射治疗第一周和第三周时,使用足底痛觉测量仪和热板仪检测小鼠坐骨神经的机械痛阈值和热感觉阈值。治疗结束后先使用电生理技术检测小鼠坐骨神经的动作电位幅度和神经纤维传导速度,并使用血糖分析仪检测小鼠血糖水平以及电子天平称量小鼠体重,然后处死小鼠并提取坐骨神经,使用透射电镜技术观察小鼠坐骨神经的超微结构变化;免疫组织化学技术检测小鼠坐骨神经LC3的表达。2.Western Blot、免疫细胞荧光、细胞增殖实验、透射电镜检测石蒜碱处理对体外高糖培养的RSC96细胞自噬的影响（1）检测不同浓度石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响。RSC96细胞使用含10%的胎牛血清及1%的青霉素和链霉素混合液的DMEM培养基培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。高糖培养的RSC96细胞随机分为五组,石蒜碱处理浓度分别为:0μg/mL、0.96μg/mL、1.44μg/mL、2.87μg/mL、5.74μg/mL。处理48 h后收集细胞并提取总细胞蛋白,Western Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ的表达。（2）检测自噬通量抑制剂Pepstatin和Aloxistatin对石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响。RSC96细胞随机分为三组,正常糖组（normal glucose）、高糖+DMSO组（high glucose+DMSO）、高糖+石蒜碱组（high glucose+Lycorine）,每组均给予10μmol/L pepstatin和10μmol/L aloxistatin。处理48 h后收集细胞并提取总细胞蛋白,Western Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ的表达。（3）检测石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞自噬相关蛋白的表达的影响。RSC96细胞随机分为三组,正常糖组（normal glucose）、高糖+DMSO组（high glucose+DMSO）、高糖+石蒜碱组（high glucose+Lycorine）。处理48 h后收集细胞并提取总细胞蛋白,Western Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7的表达,免疫细胞荧光检测LC3、P62、Beclin-1、ATG3的表达。（4）检测敲低ATG3对石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响。RSC96细胞随机分为二组,高糖+石蒜碱+pGenesil-1组（high glucose+Lycorine+NC）、高糖+石蒜碱+pGenesil-1-ATG3组（high glucose+Lycorine+ATG3 sh RNA）。转染并处理48 h后收集细胞并提取总细胞蛋白,Western Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ的表达。（5）检测石蒜碱处理对RSC96细胞活力的影响。RSC96细胞接种于96孔板中,每孔细胞数约3000个。RSC96细胞随机分为四组,正常糖+DMSO组（normal glucose+DMSO）、正常糖+石蒜碱组（normal glucose+Lycorine）、高糖+DMSO组（high glucose+DMSO）、高糖+石蒜碱组（high glucose+Lycorine）。处理48 h后,每孔加入10μL的CCK8试剂,然后使用酶标仪测量450 nm处吸光度。（6）检测石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞超微结构变化的影响。RSC96细胞随机分为二组,高糖+DMSO组（high glucose+DMSO）、高糖+石蒜碱组（high glucose+Lycorine）。处理48 h后收集细胞,电镜液固定细胞后使用透射电镜技术观察RSC96细胞超微结构的变化。3.Western Blot、Real-time PCR、免疫细胞荧光检测石蒜碱处理对体外高糖培养的RSC96细胞MMP9表达的影响及MMP9对石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞自噬的影响（1）检测石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞MMP9表达的影响。RSC96细胞随机分为三组,正常糖组（normal glucose）、高糖+DMSO组（high glucose+DMSO）、高糖+石蒜碱组（high glucose+Lycorine）。处理48 h后收集细胞并提取总细胞蛋白及mRNA,Western Blot检测MMP9蛋白的表达,Real-time PCR检测MMP9 mRNA的表达,免疫细胞荧光检测MMP9的表达。（2）检测过表达MMP9和敲低MMP9对RSC96细胞Beclin-1、ATG3、LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响。RSC96细胞随机分为四组,高糖+石蒜碱+pCMV3组（high glucose+Lycorine+NC）、高糖+石蒜碱+pCMV3-MMP9组（high glucose+Lycorine+MMP9 OE）、高糖+pGenesil-1组（high glucose+NC）、高糖+pGenesil-1-MMP9组（high glucose+MMP9 sh RNA）。转染并处理48 h后收集细胞并提取mRNA及总细胞蛋白,Real-time PCR检测MMP9mRNA的表达,Western Blot检测Beclin-1、ATG3、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达,免疫细胞荧光检测LC3的表达。4.Western Blot、Real-time PCR、免疫细胞荧光检测AMPK信号通路对石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞MMP9表达的影响（1）检测石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞AMPK信号通路的影响。RSC96细胞随机分为三组,正常糖组（normal glucose）、高糖+DMSO组（high glucose+DMSO）、高糖+石蒜碱组（high glucose+Lycorine）。处理48 h后收集细胞并提取总细胞蛋白,Western Blot检测AMPK、phospho-AMPK（Thr 172）的表达,免疫细胞荧光检测phospho-AMPK（Thr 172）的表达。（2）检测AMPK通路抑制剂Compound C与激活剂AICAR对RSC96细胞AMPK、phospho-AMPK（Thr 172）、MMP9表达的影响。RSC96细胞随机分为六组,正常糖+DMSO组（normal glucose+DMSO）、正常糖+Compound C组（normal glucose+Compound C）、高糖+DMSO组（high glucose+DMSO）、高糖+AICAR组（high glucose+AICAR）、高糖+石蒜碱+DMSO组（high glucose+Lycorine+DMSO）、高糖+石蒜碱+Compound C组（high glucose+Lycorine+Compound C）。处理48 h后收集细胞并提取总细胞蛋白及mRNA,Western Blot检测AMPK、phospho-AMPK（Thr 172）表达,Real-time PCR检测MMP9 mRNA的表达。结果:1.石蒜碱治疗改善糖尿病小鼠坐骨神经的结构与功能糖尿病小鼠血糖（29.59±3.65 mmol/L）明显高于正常对照组（7.94±2.41 mmol/L）（P＜0.01）,糖尿病小鼠体重（19.04±4.07 g）与正常小鼠（23.69±2.61 g）相比下降（P＜0.05）,而注射石蒜碱的糖尿病小鼠与注射生理盐水的糖尿病小鼠相比,二者血糖和体重无明显差异（P＞0.05）。足底痛觉测量仪和热板仪测试结果表明,与正常小鼠相比,糖尿病小鼠的机械痛阈值和热感觉阈值明显升高（P＜0.05）,而石蒜碱治疗可以使糖尿病小鼠的热感觉阈值降低36.12%（P＜0.05）。电生理技术检测结果表明,石蒜碱治疗使糖尿病小鼠坐骨神经的神经纤维传导速度提高1.2倍（P＜0.05）,而小鼠坐骨神经的动作电位幅度未见明显变化（P＞0.05）;透射电镜结果表明,石蒜碱治疗可有效改善糖尿病导致的小鼠坐骨神经髓鞘内折叠和外折叠异常;免疫组织化学结果表明,与正常小鼠相比,糖尿病小鼠坐骨神经LC3的表达降低,石蒜碱治疗可以逆转糖尿病小鼠坐骨神经LC3表达的降低。2.石蒜碱处理改善体外高糖培养的RSC96细胞的自噬（1）不同浓度石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响。Western Blot结果显示,高糖使LC3II/I比值下降（P＜0.05）,而在高糖条件下,与0μg/mL石蒜碱相比,1.44μg/mL和2.87μg/mL石蒜碱使RSC96细胞的LC3II/I比值升高较明显。（2）自噬通量抑制剂Pepstatin和Aloxistatin对石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响。Western Blot结果显示,石蒜碱处理明显逆转高糖条件下LC3Ⅱ表达的降低（P＜0.01）。（3）石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞自噬相关蛋白的表达的影响。Western Blot结果显示,与正常糖组相比,高糖组LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、ATG3的表达明显降低（P＜0.05）,而ATG5、ATG7的表达没有降低。在高糖条件下培养的RSC96细胞,2.87μg/mL石蒜碱处理与等量DMSO处理相比,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高2.23倍（P＜0.05）、P62的表达升高1.47倍（P＜0.05）、Beclin-1升高1.48倍（P＜0.05）、ATG3升高1.85倍（P＜0.05）。免疫细胞荧光结果与Western Blot结果一致,石蒜碱处理上调了高糖条件下培养的RSC96细胞中LC3、P62、Beclin-1、ATG3的表达。（4）敲低ATG3对石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响。Western Blot结果显示,敲低ATG3后,石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ的比值明显下调（P＜0.05）。（5）石蒜碱处理对RSC96细胞活力的影响。细胞增殖能力实验结果表明,在正常糖或高糖条件下,石蒜碱处理或DMSO处理对RSC96细胞活力的影响均无明显差异（P＞0.05）。（6）石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞超微结构变化的影响。透射电镜结果显示,高糖条件下的RSC96细胞线粒体和内质网发生肿胀,自噬小体数目减少,而石蒜碱处理可以改善线粒体和内质网肿胀,并诱导自噬小体形成。3.石蒜碱处理降低RSC96细胞MMP9的表达并促进细胞自噬（1）石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞MMP9表达的影响。Real-time PCR结果显示,与正常糖组相比,高糖组MMP9 mRNA的表达明显升高。在高糖条件下培养的RSC96细胞,石蒜碱处理与等量DMSO处理相比,MMP9 mRNA的表达降低了76.85%（P＜0.05）。Western Blot结果显示,与正常糖组相比,高糖组MMP9的表达升高1.37倍（P＜0.05）。在高糖条件下培养的RSC96细胞,石蒜碱处理与等量DMSO处理相比,MMP9的表达降低了51.59%（P＜0.05）。免疫细胞荧光结果与Western Blot结果一致,石蒜碱处理对高糖条件下培养的RSC96细胞中MMP9的表达有显著的负调控作用。（2）过表达MMP9对石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞Beclin-1、ATG3、LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响。Real-time PCR结果显示,石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞转染MMP9过表达质粒后,MMP9 mRNA表达显著升高。Western Blot结果显示,在石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞中过表达MMP9使Beclin-1的表达降低了11.94%（P＜0.05）、ATG3的表达降低了35.21%（P＜0.05）、LC3Ⅱ/Ⅰ的比值降低了43.09%（P＜0.05）。免疫细胞荧光结果显示,石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞中转染过表达MMP9质粒后,LC3的表达明显减弱。（3）敲低MMP9对高糖培养的RSC96细胞Beclin-1、ATG3、LC3Ⅱ/Ⅰ表达的影响。Real-time PCR结果显示,高糖培养的RSC96细胞转染MMP9敲低质粒后,MMP9 mRNA表达显著降低。Western Blot结果显示,在高糖条件下培养的RSC96细胞中敲低MMP9使Beclin-1的表达升高了1.19倍（P＜0.05）、ATG3的表达升高了1.21倍（P＜0.05）、LC3Ⅱ/Ⅰ的比值升高了1.62倍（P＜0.05）。4.石蒜碱通过激活AMPK信号通路降低RSC96细胞MMP9的表达（1）石蒜碱处理对高糖培养的RSC96细胞AMPK信号通路的影响。Western Blot结果表明,与正常糖组相比,高糖组phospho-AMPK（Thr 172）的表达明显降低（P＜0.05）。在高糖条件下培养的RSC96细胞,石蒜碱处理与等量DMSO处理相比,phospho-AMPK（Thr 172）的表达升高2.09倍（P＜0.05）。免疫细胞荧光结果与Western Blot结果一致,石蒜碱处理上调了高糖条件下培养的RSC96细胞中phospho-AMPK（Thr 172）的表达。（2）AMPK通路抑制剂Compound C和激活剂AICAR对RSC96细胞AMPK、phospho-AMPK（Thr 172）、MMP9表达的影响。Western Blot结果显示,在正常糖条件下培养的RSC96细胞,Compound C处理与等量DMSO处理相比,phospho-AMPK（Thr 172）的表达降低（P＜0.05）,在高糖条件下培养的RSC96细胞,AICAR处理与等量DMSO处理相比,phospho-AMPK（Thr 172）的表达升高（P＜0.05）。Real-time PCR结果显示,在正常糖条件下培养的RSC96细胞,Compound C处理与等量DMSO处理相比,MMP9 mRNA的表达升高（P＜0.05）,在高糖条件下培养的RSC96细胞,AICAR处理与等量DMSO处理相比,MMP9 mRNA的表达降低（P＜0.05）,在石蒜碱处理的高糖培养的RSC96细胞中,Compound C处理与等量DMSO处理相比,MMP9 mRNA的表达升高了1.23倍（P＜0.05）。结论:1.石蒜碱治疗可以改善糖尿病小鼠坐骨神经的结构与功能。2.石蒜碱能够改善体外高糖培养的施万细胞的自噬。3.石蒜碱通过降低MMP9的表达增强高糖条件下施万细胞的自噬。4.石蒜碱通过激活AMPK信号通路来降低MMP9的表达。