一个可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭质粒的构建

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将板栗疫病菌整合性质粒pCPXHY2上的由Trpc启动子控制的潮霉素基因片段克隆到农杆菌转化载体质粒pCambia1301—35SN外源基因克隆位点上,构建成一个新的质粒pGXH1130。用pGXH1130转化板栗疫病菌EP713原生质体,其转化效率是pCPXHY2的6倍以上,达到60~70个转化子/μg。挑取的5868个转化子没有一个发生表型突变,其生长速度、菌体颜色、菌落形态均与EP713相似。通过对转化子总DNA进行Southern杂交分析,pGXH1130转化板栗疫病菌后并未插入染色体基因组中,而是游离于板栗疫病菌染色体外,以一个自主复制的质粒形式存在。将转化子总DNA转化E.coli,回收到与pGXH1130大小一致的质粒。经RFLP(EcoRI、XbaI、SalI)分析,pGXH1130转入EP713后未经任何修饰或剪切。对转化子潮霉素抗性表型稳定性检测表明,在没有潮霉素选择压力下,经过6次转接,90%的菌体中pGXH1130会丢失。能自主复制的pGXH1130穿梭质粒的成功构建,为板栗疫病菌的遗传操作提供了一个强大的新的工具。
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