1977年Hearse首次提出心肌缺血/再灌注损伤（Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury，MIRI），MIRI指在心肌在急性缺血的基础上恢复血流供应后，心肌组织的损害反而加重，或者出现不可逆性损伤的现象。再灌注会可引起心肌细胞不可逆性坏死，表现为心肌梗死并未因血液恢复供应而减少，有时梗死面积反而增加。MIRI常见于心梗溶栓治疗、冠状动脉搭桥术、经皮腔内冠脉血管成型术、瓣膜置换术等心脏手术。其主要临床表现为再灌注性心律失常和心肌顿抑。MIRI的病理机制主要包括：氧化应激反应、细胞内钙超载、炎症反应激活等。　　钙是细胞外信号转导途径中重要的第二信使，细胞内钙离子稳态可以维持和调节细胞功能。钙超载是指由于各种原因引起细胞内钙含量异常增多并且导致细胞结构损伤和功能障碍的现象。线粒体内高浓度的Ca2+是导致线粒体通透性转换孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore，mPTP）大量开放的主要因素，mPTP开放会引起线粒体肿胀并释放凋亡和坏死相关因子，这些因子会激活凋亡执行蛋白从而引起细胞死亡，I/R时，细胞内高浓度的钙离子还可以促进氧自由基生成、加重酸中毒、电重构、激活蛋白酶与核酶等，引起细胞膜破坏、结构蛋白分解及染色体损伤，导致细胞死亡，因此钙超载是造成MIRI的关键因素之一，降低I/R期间心肌细胞内Ca2+浓度对保护受损心肌至关重要。　　钙库操纵的钙通道（Store-Operated Calcium Entry，SOCE）是表达于所有细胞（兴奋性和非兴奋性细胞）、介导细胞钙内流的主要钙通道。在神经元、骨骼肌和心肌细胞中，SOCE通道常与电压门控钙通道共同表达。尽管SOCE在心肌细胞中表达，但其在维持心肌细胞钙稳态中发挥的作用依然未完全阐明。SOCE通道的分子组成十分复杂，目前研究较为确定的是由单跨内质网膜的钙离子感应器STIM1和四跨膜Orai1共同组成的SOCE通道，其独特的电生理特征表现为：高度钙离子选择性和内向整流。近年来研究表明，经典瞬时受体电位（Canonical Transient Receptor Potential，TRPC）亦参与构成SOCE。TRPC具有七个成员（TRPC1-7）。根据氨基酸序列同源性，TRPC又分为TRPC1,2,4,5及TRPC3,6,7两个亚类，TRPC2在人类细胞中为假基因而不表达。TRPC通道的激活与细胞功能密切相关。TRPC在正常成年心肌细胞中的表达较低，但是在心肌病理性状况下表达增加。TRPC通道被认为是引起病理性心肌肥大、心肌重构、心梗等的Ca2+依赖信号通路的发起者，但是否通过TRPC通道增加MIRI的钙超载从而影响MIRI，目前尚未见相关文献报道。　　本课题组利用WT和TRPC3/6/7KO小鼠建立MIRI模型（在体），利用H9c2细胞系建立H/R模型（离体），在前期研究的基础上进一步系统地探讨TRPC3/6/7通道对心肌缺血/再灌注损伤和细胞缺氧/复氧损伤的影响。结果表明：TRPC3/6通道参与了MIRI的发生，TRPC3/6/7基因敲除能减轻MIRI。　　1、心肌细胞中TRPC通道参与了SOCE，TRPC通道抑制剂SKF96365能减少SOCE　　本课题组通过钙影像技术检测H9c2心肌细胞系和心肌原代细胞，发现5μM的TRPC抑制剂SKF96365能够显著抑制由SERCA泵抑制剂毒胡萝卜素（Thapsigargin，Tg）诱导的SOCE，TRPC3/6/7KO小鼠原代心肌细胞的SOCE比WT小鼠原代心肌细胞的低，而5μM的SKF96365不能显著改变依赖Orai1的钙释放激活的钙通道（Ca-release activated Ca（CRAC）channels）。为明确TRPC3/6/7KO小鼠是否制备成功，对WT小鼠和TRPC3/6/7KO小鼠的TRPCs进行了检测，RT-PCR检测显示：WT组TRPC1、2、3、4、6在mRNA水平均有表达，TRPC5、7无表达，TRPC3/6/7KO组TRPC1、2、4在mRNA水平均有表达，TRPC3、5、6、7无表达，免疫组化结果显示WT组小鼠原代心肌细胞TRPC3、6均有表达、TRPC7则无表达，TRPC3/6/7KO组小鼠原代心肌细胞TRPC3、6、7均无表达。上述结果提示TRPC3/6/7KO小鼠制备成功，TRPC6和（或）TRPC3参与了SOCE，抑制TRPC通道能减少SOCE。　　2、SKF96365减少H9c2细胞缺氧/复氧的损伤　　为了探讨TRPC通道对H9c2细胞线粒体膜电位的影响，采用JC-1荧光探针检测缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）时线粒体膜电位的变化，复氧时加入不同浓度的TRPC抑制剂SKF96365，结果显示线粒体膜电位随着SKF96365浓度增加而逐渐升高，由此提示TRPC通道可以增强H/R过程中的Ca2+内流而降低线粒体膜电位而促进凋亡。为了进一步研究I/R的相关信号分子机制，利用H9c2细胞体外H/R实验模拟在体心肌缺血再灌注损伤，在复氧时加入TRPC通道抑制剂SKF96365和PI3K抑制剂LY294002，以探讨其在心肌缺血再灌注损伤中的作用，通过免疫印迹技术检测，结果显示：H/R后，CaNα、CaNβ、Bax、cleaved caspase3增加，p-AKT、p-GSK3β、Bcl2降低，复氧时加入SKF96365时，能部分逆转H/R的结果。复氧时加入LY294002时，阻断了SKF96365的逆转效果。为了确认是否H/R对TRPC通道有影响，我们检测了H/R后TRPC3和TRPC6的改变，结果显示H/R后，TRPC3和TRPC6蛋白表达增加。为了进一步确认是否H/R导致TRPC通道上调也会在I/R时出现，我们检测了I/R后的心肌组织AAR区，结果显示在WT小鼠，TRPC3和TRPC6的表达增加，而TRPC3/6/7KO小鼠未发生改变，这一结果也证明了TRPC3和TRPC6抗体的特异性。以上结果说明TRPC3和TRPC6参与了H/R和I/R过程，TRPC通道抑制剂SKF96365能减少H/R后H9c2细胞的凋亡。　　3、TRPC3/6/7基因敲除改善心肌缺血再灌注损伤　　为明确TRPC3/6/7基因敲除对MIRI的影响，采用Evans-Blue/TTC染色法检测小鼠心肌梗死面积（Infarct size，IS），结果显示TRPC3/6/7KO小鼠I/R后IS明显下降。通过TUNEL染色法检测I/R后心脏AAR区域组织细胞凋亡率，结果显示TRPC3/6/7KO小鼠I/R后心肌细胞凋亡率较低。通过超声心动图检测I/R后心功能的变化，结果显示TRPC3/6/7KO小鼠I/R后心脏平均射血分数（EF）和左心室缩短分数（FS）受到部分损伤，而WT小鼠EF和FS损伤严重。通过电镜观察I/R后AAR区域心肌细胞超微结构的变化，结果显示WT组小鼠I/R后AAR区域出现肌节模糊，肌丝溶解，线粒体嵴溶解或破坏的情况较重。以上结果说明TRPC3/6/7基因敲除能减轻I/R引起的心肌损伤。4、I/R后，TRPC3/6/7KO小鼠通过抑制CaN-NFAT信号通路和上调PI3K-AKT-GSK3β生存信号通路减少心肌细胞凋亡　　为探讨TRPC3/6/7基因敲除改善心肌缺血再灌注损伤的机制，采用免疫印迹技术对I/R后心肌AAR区域组织相关信号分子进行检测，结果显示TRPC3/6/7基因敲除后，CaNα、CaNβ、p-NFATc3、BAX、cleaved caspase3的表达水平降低，Bcl2、p-AKT、p-GSK3β表达水平明显上升。为了进一步研究NFAT与TRPC3和TRPC6的关系，我们通过用p-NFAT去磷酸化抑制剂11R-VIVIT预处理H9c2细胞，结果显示H9c2细胞H/R后11R-VIVIT抑制了TRPC3，TRPC6和BAX的上调。这些结果提示TRPC3/6/7基因敲除通过抑制CaN-NFAT信号通路和上调PI3K-AKT-GSK3?生存信号通路减少心肌细胞凋亡，从而改善心肌缺血再灌注损伤。　　本实验结果表明，H/R-I/R通过TRPCs引起Ca2+内流，激活Ca2+→CaM→CaN→NFATc正反馈信号通路，在这个过程中，TRPC3和TRPC6的蛋白表达增加和功能增加，进一步引起Ca2+内流增加；而TRPC3/6/7基因敲除则可下调Ca2+→CaM→CaN→NFATc通路的活性，减轻心肌细胞钙超载，从而减轻心肌缺血再灌注损伤，降低心肌细胞凋亡率。因此，本研究为MIRI的发病机制及临床治疗MIRI提供了新的实验基础。