兴国红鲤和荷包红鲤MHC Ⅱ类基因多态性、表达及其与鱼体抗病力关系的分析

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红鲤是中国极为重要的鱼类育种材料之一,其中兴国红鲤(Cyprinus carpiovar. singuonensis)与荷包红鲤(Cyprinus carpio var. wuyuanensis)的经济价值较大,在养殖生产上发挥着举足轻重的作用。在红鲤的养殖过程中,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为主要病原菌之一,但目前尚未有控制该细菌性病爆发的有效防制措施。而培育抗病品种,是解决鱼类病害的根本途径。主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)的高度多态性及与机体抗病力的相关性,使其可作为遗传分子标记,辅助选择含抗性MHC等位基因的亲鱼来进行抗病育种改良,以培育出高产、抗病力强的品种。本研究既分析兴国红鲤与荷包红鲤的MHC II类α、β基因多态性及其与嗜水气单胞菌抗性的关系,又采用实时定量PCR方法,检测这两个基因在兴国红鲤与荷包红鲤各组织的表达情况,研究结果将为红鲤抗病品种选育提供基础资料。主要结果如下:1.兴国红鲤MHC II类α基因多态性、表达及其与鱼体抗病力关系的分析对41尾感病和22尾抗病兴国红鲤的308个有效克隆进行测序,获得171条不同的MHC II类α基因编码序列,分属26个不同的等位基因,其中Cyca-DXA24-Cyca-DXA36为新发现的13个等位基因。MHC II类α基因片段的长度为624bp,包括第1-4个外显子,分别编码信号肽、α1和α2结构域及连接肽/跨膜区。α1结构域的变异明显大于α2结构域,表现在α1结构域中核苷酸和氨基酸变异位点比例(55.16%和79.76%)明显高于α2结构域的变异位点比例(45.96%和68.42%)。α1结构域的抗原结合位点(PBR)的非同义碱基替换率(dN)与同义碱基替换率(dS)的比值ω(ω=dN/dS)为5.742,远远高于非抗原结合位点(non-PBR)及α2结构域的0.755、0.592,揭示兴国红鲤MHC II类α基因的α1结构域在进化过程中受到正向选择作用。等位基因Cyca-DXA24(P <0.01)与兴国红鲤对嗜水气单胞菌的抗性相关,等位基因Cyca-DXA3(P <0.05)、Cyca-DXA4(P <0.01)、Cyca-DXA6(P <0.05)、Cyca-DXA33(P <0.05)与兴国红鲤对嗜水气单胞菌的易感性相关。荧光定量PCR结果表明,MHC II类α基因在健康兴国红鲤的肾、肝、鳃等10个组织均能普遍表达。人工感染嗜水气单胞菌后,肾、肝、脾3个组织中的MHCII类α基因的表达量均发生了不同程度的变化,表明MHC II类α分子在兴国红鲤的免疫反应中起到重要作用。2.兴国红鲤MHC II类β基因多态性、表达及其与鱼体抗病力关系的分析利用DABF和DABR引物从41尾感病和22尾抗病兴国红鲤的cDNA中扩增出长度为624bp的MHC II类β基因片段。分析291个有效克隆的测序结果,获得150个不同的编码序列,分属33个不同的等位基因,其中Cyca-DAB1*17-Cyca-DAB1*21和Cyca-DAB3*24-Cyca-DAB3*34为新发现的16个等位基因。MHC II类β基因片段包括第1-4个外显子,分别编码信号肽、β1和β2结构域及连接肽/跨膜区。β1结构域的核苷酸、氨基酸变异位点分别为189个(68.48%)和80个(86.96%);而β2结构域的核苷酸、氨基酸变异位点较少,分别为145个(51.42%)和72个(76.60%),显示β1结构域的变异明显大于β2结构域。β1结构域的PBR、non-PBR及β2结构域的dN与dS的比值ω分别为1.796、0.956、0.740,表明兴国红鲤MHC II类β基因的β1结构域在进化过程中受到正向选择作用。等位基因Cyca-DAB1*17在抗病群体中出现的频率(12.87%)显著高于感病群体中出现的频率(4.74%,P <0.05)。荧光定量PCR分析组织表达发现,在所检测的健康兴国红鲤各组织中,均扩增出MHC II类β基因片段。感染嗜水气单胞菌后,肾、肝、脾3个组织中的MHC II类β基因mRNA水平均发生了不同程度的变化,表明MHCII类β分子在兴国红鲤的免疫反应中起到重要作用。3.荷包红鲤MHC II类α基因多态性、表达及其与鱼体抗病力关系的分析对荷包红鲤24尾感病个体中的111条序列和17尾抗病个体中的85条序列进行分析,获得114条不同的MHC II类α基因编码序列,分属15个不同的等位基因,其中Cyca-DXA18-Cyca-DXA23为新发现的6个等位基因。长度为624bp的MHCII类α基因片段,包括第1-4个外显子,分别编码信号肽、α1和α2结构域及连接肽/跨膜区。α1结构域的变异明显大于α2结构域,表现为长度为252bp的α1结构域有124个核苷酸变异位点(49.21%)和65个氨基酸变异位点(77.38%),而长度为285bp的α2结构域只有97个核苷酸变异位点(34.04%)和51个氨基酸变异位点(53.68%)。α1结构域的PBR、non-PBR及α2结构域的ω值分别为7.167、0.925、0.397,揭示荷包红鲤MHC II类α基因的α1结构域在进化过程中受到正向选择作用。等位基因Cyca-DXA4(P <0.01)、Cyca-DXA5(P <0.01)与荷包红鲤对嗜水气单胞菌的易感性相关,等位基因Cyca-DXA17(P <0.01)、Cyca-DXA18(P <0.01)、Cyca-DXA19(P <0.05)与荷包红鲤对嗜水气单胞菌的易感性相关。荧光定量PCR结果显示,MHC II类α基因在荷包红鲤正常各组织、以及感染嗜水气单胞菌后肾、肝、脾组织中的表达情况,与兴国红鲤的趋势一致。4.荷包红鲤MHC II类β基因多态性、表达及其与鱼体抗病力关系的分析以24尾感病和17尾抗病荷包红鲤的cDNA为模板进行PCR扩增和克隆分析,获得长度为624bp的MHC II类β基因不同编码序列110条,分属17个不同的等位基因,其中Cyca-DAB1*14-Cyca-DAB1*16和Cyca-DAB3*23为新发现的4个等位基因。MHC II类β基因片段包括第14个外显子,分别编码信号肽、β1和β2结构域及连接肽/跨膜区。β1结构域的核苷酸、氨基酸变异位点比例为63.04%和81.52%,β2结构域的分别为47.52%和71.28%。β1结构域的PBR、non-PBR及β2结构域的ω值分别为2.525、0.927、0.735,表明荷包红鲤MHC II类β基因的β1结构域在进化过程中受到正向选择作用。等位基因Cyca-DAB1*07在感病群体中出现的频率(18.26%)显著高于抗病群体中出现的频率(5.00%,P <0.05),等位基因Cyca-DAB3*23在抗病群体中出现的频率(13.75%)显著高于感病群体中出现的频率(5.22%,P <0.05)。荧光定量PCR结果显示,MHC II类β基因在荷包红鲤正常各组织、以及感染嗜水气单胞菌后肾、肝、脾组织中的表达情况,也与兴国红鲤的趋势一致。
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