结合HIV-1 gP41 NHR的环肽及模拟gP41融合核心结构表位的筛选与鉴定 AIDS为感染HIV-1病毒后所致的继发性免疫缺陷综合症。目前针对HIV感染及AIDS患者的主要治疗药物仍是联合应用逆转录酶抑制剂（PTI）和蛋白酶抑制剂（PI），即鸡尾酒疗法。但该疗法主要针对HIV感染后期，长期应用有毒、副作用且易诱导病毒突变株产生。 HIV-1跨膜蛋白gp41在病毒和细胞融合中发挥关键作用。当gp120与靶细胞表面的CD4及共受体结合后，gp41胞外段N-末端重复序列（NHR）与C—术端重复序列（CHR）相互作用，形成六螺旋束（6—HB），即gp41融合活性核心，从而导致病毒融合。源于gp41 CHR的合成肽如C34、T20肽可有效抑制HIV—1介导的细胞融合。因此gp41胞外段已成为研制新型抗HIV的药物靶点。 本研究的目标是：1．筛选针对HIV-1介导细胞融合的肽类先导化合物，对模拟HIV-1 gp41 C螺旋的坏肽抑制病毒与细胞融合作用进行初步鉴定；2．筛选并鉴定HIV-1 gp41核心表位和gp41 NHR结合表位。 本研究包括以下三个部分： 一、HIV-1 gp41 NHR结合序列的筛选与鉴定 1、用源于HIV-1 gp41 N端的肽N36，以PL+S法筛选坏七肽库，得到16个阳性克隆，竞争抑制实验表明阳性克隆No.8与N肽的结合可被C34所阻断。挑选10个阳性克隆测序并推导氨基酸序列，得到8种序列：CQHWWHWYC，CVHWWHWIC，CYWWHRLHC，CTWWRPWHC，CHPHWWRTC，CWYWHAKHC，CFWWHTRHC以及CPAPDQSMC。所有序列富含疏水氨基酸，其中9个克隆均有WW、7个克隆有WWH保守序列，W可模拟C螺旋中的W628及W631与N螺旋中的疏水口袋区相互作用。 2、用固相化N36肤筛选噬菌体环七肤库（P+LS法），经EL工SA鉴定有n个克隆可特异地与N36肤结合，阳性克隆与N36的结合可被C34和ADS一Jl所抑制。DNA序列分析表明这n个克隆为同一序列，推导的氨基酸序列为CDRHQHKRC。 3、以针对gp41 HR区域的多克隆抗体为靶，筛选环七肤库，13个噬菌体克隆可特异性地与该多抗结合，而不与正常兔工gG结合，ELIsA鉴定表明其中的8个阳性克隆可与N36月太结合。将这8个克隆进行DNA测序并推导氨基酸序列，得到单一序列:CPYGPKLC。提示cPYGPKLC为gp41 NHR结合序列。二、川V--1 gp41 NHR结合肤的合成与鉴定 1、根据游离N36肤筛选所得的阳性克隆No.8所展示的序列CYWWHRLHC，固相合成环肤FJ一08一Ex（序列为SACYWWHRLHCGGGS）。与无关肤相比较，细胞融合抑制实验显示在2小时内，FJ一08一Ex（）80瑰/m1)有抑制融膜作用，呈现浓度依赖效应。然而随着时间的延长（超出2小时），FJ一08一Ex的活性消失，与对照13b月太无明显区别。FJ一08一Ex能抑制HIV介导的膜融合（2小时细胞融合实验），但不能抑制合胞体的形成（24小时合胞体形成实验），提示该序列可模拟c多肤与H工V一1 gp41的N螺旋相互作用，抑制HIV一1介导的细胞融合。但因其亲和力较低，导致其抑制作用随时间延长而降低。上述结果提示可以FJ一08一Ex为基础进行改造以获得可抑制HIV融合的、亲和力高的肤类抑制剂。 2、根据固相化N36肤筛选后所得的阳性序列CDRHQHKRC合成环肤NA （SACDRHQHKRCGG）。NA与BSA的交联物可与N36肤特异性结合，竞争EL工SA显示C34月太和游离N36肤可抑制NA一BSA与N36结合，说明NA肤模拟gp41 CHR的抗原性。三、川v--1 gp41核心表位的筛选与鉴定 以针对gp41核心结构的单克隆抗体NC一为靶，筛选噬菌体线性12肤库，得到10个特异地与NC注结合的阳性噬菌体克隆，DNA测序并推导氨基酸，共5种线性表位:HDVHHRWVYLLS，ITVNEWLYTSEQ，HGRSHGMFKPKR，MGPIARPHwHLN，DMYRSPRPKPDT。gp41N肤和C月太所形成的复合物可特异地阻断表达HnVHHRWVYLLS，ITVNEWLYTSEQ和MGP工ARPHWHLN的克隆与NC一的结合。上述结果说明这4种序列为gp41核心表位。