【研究背景与目的】据美国的最新癌症统计，在女性恶性肿瘤死亡原因中，卵巢癌排名第四位，死亡率居首位。由于缺乏有效的早期筛查手段，70％的卵巢癌患者就诊时已届晚期。虽然近20年来在卵巢癌治疗方面取得了长足的进展，卵巢癌手术技巧不断提高，新型化疗药物、化疗方案亦陆续投入临床使用，但这些传统的治疗手段均未能显著改善患者长期生存率，70％的晚期卵巢癌患者最终复发并死于癌症。因此寻找特异性强、敏感性高的卵巢癌相关抗原，并探索有效的综合治疗方法具有重要的临床意义。近年来，以基因和免疫治疗为代表的生物治疗作为肿瘤治疗的第四模式日益受到重视，作为晚期卵巢癌治疗的重要辅助手段之一，生物治疗已逐渐显示出其独特的优越性。最近研究发现：位于11q13.5的RSf-1／HBXAP基因的扩增在分子遗传学、转录分析、临床预后和功能表达等方面与卵巢、乳腺、头颈部等恶性肿瘤的发生密切相关。Rsf-1／HBXAP基因在肿瘤发生发展中对基因扩增与染色质调节起一定的作用。Rsf-1／HBXAP基因过表达参与刺激细胞增殖和恶性转化过程，而基因敲除抑制卵巢癌细胞的生长和扩增。Rsf-1／HBXAP基因在卵巢癌细胞系中高表达，在卵巢癌病人腹水细胞中表达上调，并与预后相关。因此，Rsf-1／HBXAP基因有望成为卵巢癌免疫生物治疗的靶点。肿瘤的细胞免疫主要是T细胞免疫，依赖于有效的抗原递呈。树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内功能最强的唯一能够激活初始型T细胞的抗原递呈细胞，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节，因此利用DC在患者体内建立起肿瘤特异性的、持久的免疫应答，是目前将DC肿瘤疫苗用于治疗恶性肿瘤的基础，也是一种有应用前景的肿瘤免疫治疗的新方法。人类肿瘤抗原与DC结合成为肿瘤特异性主动性免疫治疗的手段之一。基于以上报道，本研究以Rsf-1／HBXAP基因作为修饰DC疫苗的靶点进行卵巢癌基因及免疫治疗的实验研究。我们设想通过基因转导使树突状细胞表达Rsf-1／HBXAP抗原，由它诱导的CTL是否可以对表达Rsf-1／HBXAP基因的卵巢癌细胞产生特异的杀伤活性。因此本研究首先探讨Rsf-1／HBXAP基因是否确实在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中特异性表达，其次构建了Rsf-1／HBXAP基因与绿色荧光蛋白的重组真核表达载体，并将其转染到脐血来源的树突状细胞中，研究其是否能诱导特异的可识别Rsf-1／HBXAP⁺卵巢癌细胞的细胞毒性T淋巴，并产生有效的杀伤效应。第一部分Rsf-1／HBXAP基因在人卵巢癌组织及细胞系中的表达及意义【目的】研究卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中Rsf-1／HBXAP基因的表达情况，以明确Rsf-1／HBXAP是否在卵巢癌组织中特异性表达，并探讨其在卵巢癌发生发展中的作用。【方法】采用Real-time PCR技术检测Rsf-l／HBXAP在40例卵巢癌组织、9例交界性卵巢肿瘤及24例良性卵巢肿瘤及12例正常卵巢组织中mRNA的表达及8个常见卵巢癌细胞系及对照细胞人胚肾细胞HEK293中进行RSf-1／HBXAP基因表达的筛查。免疫组化技术检测Rsf-1／HBXAP基因在30例卵巢癌组织、10例交界性及20例良性卵巢肿瘤及8例正常卵巢组织中Rsf-1／HBXAP蛋白表达及定位。【结果】Rsf-1／HBXAP在卵巢癌组织尤其是浆液性卵巢癌中高表达，在卵巢交界性和良性肿瘤低表达，而在正常卵巢组织不表达。Rsf-1／HBXAP基因表达定位为细胞核，为核蛋白；上皮浆液性卵巢癌的表达水平明显高于其他来源及其他类型的卵巢癌组织；随临床分期的增加或分化程度的降低及淋巴结转移，Rsf-1／HBXAP的表达有递增趋势，差别具有统计学意义。8个常见卵巢癌细胞系SKOV-3，OVCAR-3，3AO，A2780，A549，TOV-112D，HRA和Caov-3中，Rsf-1／HBXAP均呈阳性表达，人胚肾细胞HEK293中不表达。【结论】Rsf-1／HBXAP基因高度表达于上皮性卵巢癌组织中，尤其是浆液性卵巢癌，与卵巢癌的临床分期、分化程度及淋巴结转移密切相关，提示其在卵巢癌的发生发展中可能起重要作用，并有望成为卵巢癌基因及生物治疗的理想靶点。第二部分Rsf-1／HBXAP基因重组真核表达载体的构建及在人胚肾细胞293中的稳定表达【目的】构建含有Rsf-1／HBXAP基因全长cDNA的绿色荧光蛋白的重组真核表达载体，并在人胚肾细胞HEK293中稳定表达。【方法】选用合适酶切位点用限制性内切酶HindⅢ和SacⅡ从pcDNA．6／V5-B载体上切下含Rsf-1／HBXAP基因全长cDNA的片段，并与pMD18-T载体连接，挑选阳性克隆经鉴定后测序。用HindⅢ和SacⅡ酶切位点将Rsf-1／HBXAP基因亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1中，经限制酶酶切鉴定，命名为pEGFP-C1／Rsf-1／HBXAP；采用脂质体法转染人胚肾细胞HEK293，G418加压筛选，并通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，应用Western blot及RT-PCR技术，分别从蛋白水平和mRNA水平鉴定稳定转染后的HEK293细胞中Rsf-1／HBXAP的表达情况。【结果】含人Rsf-1／HBXAP全长cDNA的片段用限制性内切酶HindⅢ和SacⅡ从pcDNA．6／V5-B载体上切下，经测序与已知序列完全相符。采用相同的酶切位点，将其插入pEGFP-C1真核表达质粒EGFP中的N端，使二者位于同一ORF中，最终可表达融合蛋白，经HindⅢ和SacⅡ双酶切鉴定证实连接正确；转染HEK293细胞18小时后便可在倒置荧光显微镜下看到细胞核表达的绿色荧光，并在蛋白及mRNA水平检测到Rsf-1／HBXAP的表达，而转染空载体的HEK293细胞绿色荧光位于胞浆，且无Rsf-1／HBXAP的表达；通过G418筛选建立稳定表达Rsf-1／HBXAP的HEK293-Rsf-1细胞株。【结论】pEGFP-C1／Rsf-1／HBXAP真核表达载体构建成功，Rsf-1／HBXAP与EGFP的融合并未影响其基因的亚细胞定位，这为进一步研究该基因的功能以及制备以Rsf-1／HBXAP为基础的卵巢癌疫苗奠定了实验基础。第三部分Rsf-1／HBXAP基因转导的树突状细胞诱导体外抗卵巢癌免疫效应的实验研究【目的】研究Rsf-1／HBXAP基因转染人脐血来源的树突状细胞（dendritic cells，DCs）后，对DCs生物学功能的影响，同时探讨其体外是否能够诱导出可识别Rsf-1／HBXAP⁺的卵巢癌细胞的细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T cells，CTLs），并对其产生特异性杀伤效应。【方法】采用淋巴细胞分离液自脐血分离获得单核细胞，体外经人重组细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-a、LPS诱导培养，获得DC，观察细胞形态，流式细胞技术（FACS）鉴定其表型；分别采用脂质体和原代细胞核转染技术将已构建好的含Rsf-1／HBXAP全长cDNA的真核表达载体pEGFP-C1／Rsf-1／HBXAP转染到未成熟DCs中，rhTNF-a及lipopolysaccharide（LPS）促DCs成熟。荧光显微镜下观察其蛋白定位，Western blot及RT-PCR法检测Rsf-1／HBXAP的蛋白和mRNA的表达：分别通过流式细胞技术、同种异体混合淋巴细胞反应（MLR）、OVA吞噬实验、Transwell Chemotaxis实验检测Rsf-1／HBXAP转染后对DCs表型、刺激T细胞增殖能力、对外来抗原摄取能力及迁移能力的影响；DC-Rsf-1／HBXAP与自体T细胞共培养四周后，ELISA法检测成熟DCs上清中IL-12的含量，收集效应细胞作为Rsf-1／HBXAP特异性的CTLs，通过ELISP0T和标准的⁵¹Cr释放实验对CTLs进行功能鉴定，并检测其对卵巢癌细胞OVCAR3的特异性杀伤活性。【结果】成功诱导出人脐血来源的树突状细胞：采用原代细胞核转染技术转染未成熟DCs，转染效率达50％左右，其绿色荧光蛋白定位于细胞核，Western blot及RT-PCR结果示Rsf-1／HBXAP基因修饰DCs中Rsf-1／HBXAP表达阳性，而转染空载体及未转染的DCs为阴性表达；在同种异体混合淋巴细胞反应中，随成熟DC／T比例增加。T细胞增殖明显增多，当DC／T比例为1∶10时，三组T细胞增殖活性均达到最高，其中DC-Rsf-1／HBXAP组与DC-pEGFP-C1组、未转染DCs组相比具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力（P＜0.05），而DC-pEGFP-C1组、未转染DCs组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；促成熟及转染Rsf-1／HBXAP基因后DCs表面分子CD1a、CD86表达上调，三组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；与FITC标记的OVA共孵育后，流式细胞术检测三组DCs的吞噬能力无明显差异；Transwell实验，三组DCs的迁移能力无明显差异；Rsf-1／HBXAP基因修饰的DCs可刺激CTLs特异性地分泌IFN-γ，而未转染DCs和DC-pEGFP-C1均不能诱导CTLs分泌IFN-γ；Rsf-1／HBXAP基因修饰的DCs上清中IL-12含量高于未转染DCs和DC-pEGFP-C1。DC-Rsf-1／HBXAP体外诱导的CTLs可有效杀伤高表达Rsf-1／HBXAP的卵巢癌细胞株OVCAR3和稳定转染了Rsf-1／HBXAP基因的HEK293-Rsf-1细胞，但对转染空载体的HEK293-pEGFP及单纯的HEK293细胞无杀伤活性。【结论】采用原代细胞核转染技术可提高DCs的转染效率，转染Rsf-1／HBXAP基因后可在一定程度上提高DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力，而对其抗原递呈能力、内吞能力及迁移能力无明显影响；Rsf-1／HBXAP基因修饰的DCs可诱导抗原特异性的CTLs，并产生有效的对Rsf-1／HBXAP⁺卵巢癌细胞的杀伤效应。综上所述，我们首先证实Rsf-1／HBXAP基因高表达于卵巢癌组织，尤其是浆液性卵巢癌及多数常见卵巢癌细胞系中，可以作为卵巢癌免疫生物治疗的一个候选靶点；随后成功构建了含人Rsf-1／HBXAP全长cDNA的真核表达载体pEGFP-C1／Rsf-1／HBXAP并将其导入DC，通过对转染后DC生物学功能的检测以及细胞毒杀伤实验，阐明Rsf-1／HBXAP基因可以在一定功能上提高DC刺激T细胞增殖的能力，但对抗原递呈能力、内吞功能和迁移能力均无明显影响；Rsf-1／HBXAP基因转导的CTL体外能够诱导出可特异性识别Rsf-1／HBXAP抗原的CTL，并产生针对Rsf-1／HBXAP⁺卵巢癌细胞的杀伤效应。本研究将为以Rsf-1／HBXAP为基础的卵巢癌DC疫苗的体内研究和进一步的临床应用奠定必要的实验基础。