论文部分内容阅读
分子信标是一段特殊设计的DNA发夹结构,茎部由5～7个碱基组成,环部由15～30个碱基组成,5’末端修饰荧光基团,3’末端修饰淬灭基团。当目标存在时,环部与目标结合,发夹打开,发出荧光。由于能量共振转移机制,分子信标能够在不分离未结合探针的情况下检测目标序列,且荧光强度与目标序列的浓度成正比关系,使得分子信标具有广阔的应用范围,比如基因扫描,基因芯片的构建和单核苷酸多态性的检测等。然而,分子信标本质上是一段DNA序列,在临床标本检测中能够被核酸酶分解,具有不稳定性,限制了其在临床实际中的应用。锁核酸是一种寡核苷酸衍生物,能够遵循碱基互补配对原则与单链DNA,双链DNA,RNA,LNA结合,具有高亲和力,高稳定性,体内无毒等优点。本实验采用锁核酸修饰的方法构建新型分子信标,提高了探针相关性能,并将其应用到外周血循环DNA的检测中。主要开展的研究包括：锁核酸分子信标的设计及其性能研究：采用每隔一个DNA碱基修饰一个锁核酸分子的方式,设计、合成一种新型的锁核酸修饰分子信标,环部27个碱基,茎部4个碱基。用荧光分析的方法检测锁核酸分子信标的特异性,抗酶切能力以及碱基错配识别能力等。与普通分子信标相比,锁核酸分子信标的背景荧光低,信噪比高；与DNase I在室温条件下共同孵育2h锁核酸分子信标荧光强度基本不变,提示锁核酸分子信标抗酶切能力强；分别加入完全互补的DNA片段和碱基错配片段,后者的荧光强度仅占前者的50%,提示锁核酸分子信标具有很好的碱基错配识别能力。此外,用锁核酸分子信标检测目标片段,操作简单,价格低廉,在临床核酸检测领域具有广阔的发展前景；锁核酸分子信标在外周血循环DNA检测中的应用：通过美国国家生物技术信息中心(US National Library of Medicine National Institutes,NCBI)查找UHRF1 DNA序列,并从中选出五段27个碱基对的DNA片段,采用BLAST比对分别分析其在UHRF1 DNA中的特异性,最终选定一段UHRF1 DNA序列作为本实验检测的目标序列。根据选定的UHRF1DNA序列设计锁核酸分子信标,分析检测血清中UHRF1 DNA的含量；同时用实时定量PCR检测DNA含量做结果比对。研究发现,该方法与传统的实时荧光定量PCR具有相同的趋势,检测限为11nM,检测范围是3个数量级,且所有的程序能够在1个小时内完成。更重要的是,我们所提出的方法能够区分5个乳腺癌患者和5个健康对照之间的血清UHRF1 DNA的表达。由此推断,锁核酸分子信标检测外周血循环DNA技术作为一项无创检测方法有可能在早期乳腺癌诊断和监测的方面具有广阔的应用前景。