研究背景近年来，随着分子生物学的飞速发展，许多研究表明卵母细胞成熟与蛋白质合成、磷酸化状态的改变密不可分。已证实与卵子发育和成熟相关的调控物质包括StAR(steroidogenic acute regulatory protein)、减数分裂促进因子MPF、成熟刺激因子(MPF)、丝裂原激活蛋白激酶家族(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、cAMP／蛋白激酶A(cAMP／PKA)等等，但仍有许多未知蛋白和已知蛋白参与调节的具体过程尚不清楚，需要进一步研究。探索卵母细胞成熟机制成为女性生殖领域的研究热点。蛋白质组学能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质，提供了一组蛋白质的功能及其模式的信息，能够同时反映细胞内部的遗传特性和外界因素的影响的结果。因此深入研究卵母细胞发育成熟的机制，客观上需要在蛋白质组的水平进行进一步的探索。蛋白质双向凝胶电泳-质谱技术的日趋成熟以及SELDI-TOF-MS技术的出现使蛋白质组学研究飞速发展，因为它从能够从整体水平上揭示可能参与人类疾病发生、基因调控、组织发生和发育等等蛋白分子调控机制。本研究采用SELDI-TOF-MS以及2-DE两种技术，立足于整体，在蛋白质组水平上直接研究卵母细胞发育成熟的机制。目的1．应用SELDI-TOF-MS技术，建立人成熟卵泡液及窦卵泡液的蛋白质表达指纹图谱，寻找在卵泡生长发育及卵母细胞成熟过程中起关键作用的小分子蛋白质。2．应用双向凝胶电泳-质谱技术，建立人成熟卵泡液及窦卵泡液的蛋白质谱，筛选鉴定在卵泡生长发育及卵母细胞成熟过程中起关键作用的大分子蛋白质。3．建立未成熟卵母细胞体外培养体系，研究探讨筛选鉴定得到的卵母细胞成熟相关蛋白在卵母细胞成熟过程中的作用。方法1．采用SELDI-TOF-MS技术和WCX-2蛋白芯片(弱阳离子交换蛋白质芯片)检测48例人成熟卵泡液、21例窦卵泡液中的蛋白质组分变化，PBSⅡ-C型蛋白质芯片阅读机自动读取数据，获得的结果采用Ciphergen公司的Biomarker wizard和Biomarker Patterns System软件进行分析。2．采用双向凝胶电泳-质谱技术检测48例人成熟卵泡液、21例窦卵泡液中的蛋白质组分变化，比较两组的蛋白表达差异，并对差异蛋白质点进行质谱鉴定。3．以昆明白小鼠未成熟卵母细胞为研究对象，在体外培养体系中加入不同浓度的转铁蛋白／载脂蛋白E(筛选鉴定得到的卵母细胞成熟相关蛋白)，观察其对卵母细胞减数分裂恢复、核成熟以及体外成熟的卵母细胞的受精率的影响。结果1．利用SELDI-TOF-MS技术通过WCX2芯片初步建立了人卵泡发育成熟过程中的蛋白质指纹图谱，共捕捉到53个蛋白质峰(单电荷峰)，进行成熟卵泡液与窦卵泡液的成组数据均数比较t检验，31个蛋白质峰在两组卵泡液中均低表达，18个蛋白质峰高表达，差异无显著性；4个蛋白质峰表达存在显著差异，与窦卵泡液相比，Mr6622.43、Mr7525.63两种蛋白质在成熟卵泡液表达上调，Mr2291.65、Mr9131.65两种蛋白质表达下降。2．为推测这4种差异蛋白的类别，以测定的质／荷比为理论相对分子质量，同时按照所用的质谱仪的检测误差±0.1％设定相对分子质量的误差，在ExPASy的SWISS-PROT蛋白质数据库利用Tagldent tool根据分子量在人类蛋白质数据库中模糊检索卵泡液蛋白，只有Mr为6622.43的蛋白检索到的结果是唯一的蛋白，可能是载脂蛋白C-Ⅰ亚型前体，其余三种蛋白Mr7525.63、Mr2291.65、Mr9131.65检索结果不确定。3．通过双向凝胶电泳技术，获得了较高分辨率的卵泡液蛋白质谱图，共检测到180多个蛋白质点。根据ImageMaster软件分析结果，并既往文献报道，选择了5种成熟卵泡液中表达显著增高的、且既往文献中未作过鉴定的差异蛋白质点进行MALDI-TOF分析。蛋白质点1是载脂蛋白E(ApoE)，蛋白质点5为转铁蛋白(TRF)，而蛋白质点2 PRO2044和蛋白质点3 Hypotheticalprotein根据蛋白数据库鉴定分析结果看，可能是血清白蛋白的修饰产物。蛋白质点4鉴定的结果是IgG heavy chain，仅用MS技术不足以确定IgG重链的具体分型。载脂蛋白E及转铁蛋白在卵母细胞发育成熟过程中的作用目前未见系统性的研究报道。4．在昆明系小白鼠未成熟卵母细胞体外培养体系中加入TRF，与对照组(单纯FSH组)相比，高浓度TRF组的卵母细胞GVBD发生率和PBⅠ排出率显著降低；但经TRF培养成熟的MⅡ期卵母细胞正常受精率与对照组相比显著升高，差异有统计学意义。5．在昆明系小白鼠未成熟卵母细胞体外成熟培养体系中加入ApoE，与对照组(单纯FSH组)相比，随着ApoE的浓度增加，卵母细胞的GVBD发生率和PBⅠ排出率显著降低，二者负相关；且经ApoE培养成熟的MⅡ期卵母细胞正常受精率不随着ApoE的浓度增加而改变，与对照组相比无显著差异。结论1．采用SELDI-TOF-MS以及2-DE两种蛋白质组学方法，从整体水平上建立了卵泡发育成熟不同阶段的卵泡液蛋白质图谱，发现在卵泡发育的不同阶段，卵泡液蛋白质组分种类基本一致，仅有数种蛋白质在表达量上存在显著差异。筛选鉴定了5种差异蛋白，分别是载脂蛋白E(ApoE)、PRO2044、Hypothetical protein、IgG heavy chain及转铁蛋白(TRF)，其中载脂蛋白E及转铁蛋白在卵母细胞发育成熟过程中的作用目前未见系统性的研究报道。这些蛋白可能在卵母细胞发育成熟过程中发挥关键作用，或是卵母细胞发育成熟的标志物，为研究卵母细胞成熟机制，和今后建立更完善的卵母细胞体外培养体系提供了理论依据。2．在小鼠未成熟卵母细胞体外培养体系中加入TRF进行干预，发现高浓度TRF抑制体外培养的小鼠卵母细胞发生减数分裂。正常生理状态下只有FSH受体表达最多的卵泡才能克服高浓度的TRF阻碍得以发育，卵母细胞发生减数分裂进而成熟。因此TRF是卵泡发育，特别是优势卵泡选择形成过程的重要局部调节因子，并参与卵母细胞受精过程。3．ApoE可能通过抑制卵泡膜-间质细胞分泌合成雄激素，间接降低了雌激素的合成，影响降低卵母细胞发生减数分裂。因此正常生理状态下，成熟卵泡液中特异性高表达ApoE，可以作为卵母细胞发育成熟的标志，但ApoE对MⅡ期卵母细胞的正常受精并无影响。