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原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）是生殖母细胞的前体细胞,作为一种多能干细胞,具有与胚胎干细胞相似的形态及分化潜能,能进行体外培养及传代,并能在一定前提下保持其未分化状态及多能性。现阶段PGCs体外培养体系往往存在饲养层细胞和血清,为后期研究造成困难和混淆。本研究旨在建立PGCs无饲养层无血清的体外培养体系,并在此基础上研究骨形成蛋白对PGCs体外增殖功能的影响及其机制。本论文主要研究内容如下:1.粤黄鸡原始生殖细胞无饲养层培养体系的建立。本实验根据PGC体外生长状态,在无饲养层条件下,添加多种必需因子分离培养细胞。结果显示,所得PGCs直径为6-8μm,生长曲线呈现“S”形,群体倍增时间（3.75±0.15）d,并具有良好增殖能力,免疫荧光鉴定结果显示其表达PGCs特异性基因SSEA-1与DAZL;将其用PKH26标记,注射到孵化至17HH-20HH受体鸡胚的背主动脉中,继续孵化至5.5 d,PGCs可迁移定位于性腺中,证明其具有体内迁移和分化功能。本结果为家禽PGCs应用于现代保种技术、转基因技术以及家禽的发育生物学等研究领域,提供了重要的技术前提。2.PGCs在不同培养体系中细胞特性比较。上述实验建立的无饲养层培养体系中,PGCs细胞呈悬浮生长,细胞之间无粘附,与常用的饲养层培养体系中的细胞状况有显著差异,因此从细胞大小、集落、粘附因子进行比较,结果显示,饲养层体系培养的PGCs细胞较大,细胞间黏附成集落生长,不与饲养层黏附;无饲养层培养的PGCs细胞较小,细胞间不黏附,呈散在的单个细胞生长,细胞沉落于培养板底。此两组细胞对BMP4的反应也有显著差异,无饲养层体系中加入BMP4后细胞增殖能力(OD450)明显上升;而饲养层体系中增殖不明显,但细胞间粘附能力增强,集落面积显著增大。但检测BMP4受体时,BMPR1A与BMPR2表达量在两种培养状况下无明显差异。推测可能BMP4信号途径与细胞粘附以及粘附相关信号途径同时对PGCs产生影响并,且有相互作用的通路交叉,因此继续进行两信号通路的比较实验。3.BMP4信号通路对PGC细胞增殖的调控信号途径。从上述实验可知BMP4能促进PGCs增殖,但相关信号途径还不明确。本实验从BMP4信号途径相关因子及粘附因子之间的关系进行研究。实验分为4组:饲养层培养体系（PGC组、PGCs+Noggin组）;无饲养层培养体系（PGCs+BMP4组、PGCs+Noggin+BMP4组）。qRT-PCR检测BMP4信号通路基因Smad1、Smad4、Smad5,BMP4下游靶基因Id2、BCL2及粘附基因integrinβ1,western blotting检测pSmad1/5/8、Id2、BCL2、Integrinβ1蛋白。结果显示,BMP4信号通路相关基因在无饲养层培养体系中都存在显著反应,并可被Noggin逆转;而在饲养层培养体系中反应不明显。结果证明,单细胞生长的PGCs可显著增长,可能是由于integrinβ1的粘附功能受到抑制而促增殖的功能增强所致。本研究建立了鸡PGCs的无饲养层培养体系,比较了两种培养体系中PGCs生长状态及BMP4对其的不同影响,揭示了BMP4与粘附因子的关系,为更深入的研究PGCs的分子机制奠定了基础。