论文部分内容阅读
目的骨肉瘤是最常见的原发性间叶组织恶性骨肿瘤,好发于青少年,恶性程度高,预后较差,5年生存率仅有20％。目前虽在术前术后给予化疗后生存率有所提高,但对于化疗耐受和转移复发的病例,化疗或手术常难以奏效.除了传统的手术治疗、化疗外,骨肉瘤的综合治疗特别是基因治疗为骨肉瘤的治疗取得了新的进展。IAP家族因在凋亡抵抗中可能起重要作用而日益受到重视,Livin是这个家族中的新成员,主要在肿瘤细胞中高表达,其表达水平的增高可导致细胞抗凋亡能力的增强。因此抑制Livin在骨肉瘤细胞中的表达,恢复骨肉瘤细胞对凋亡的敏感性,可能会提高骨肉瘤临床治疗效果。现在发现,抗氧化剂二巯代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)可下调IAP家族中CIAP1和CIAP2等分子的表达,促进细胞凋亡,但目前它与Livin表达之间的关系尚不清楚.本研究观察了在NF-kB抑制剂PDTC诱导骨肉瘤细胞发生凋亡的过程中,Livin和caspase-3表达水平的变化,探讨PDTC在促凋亡途径中可能发挥的作用。方法以不同浓度(0、50、100.200、400μmol/L)PDTC作用于骨肉瘤MG63细胞不同时间(24h,48h)后,(1)采用MTT法测定其PDTC对MG63细胞的抑制率；(2)采用流式细胞仪测定MG63细胞的凋亡情况；(3)采用RT-PCR和Western-blot法检测MG63细胞Livin和caspase-3的mRNA和蛋白的表达情况。结果1、不同浓度PDTC作用24h,48h后对MG63细胞生长有明显抑制作用,并呈时间、剂量依赖性。2、流式细胞仪的结果显示,50、100、200和400μmol/LPDTC作用48h后的凋亡率分别6.78士1.07％,14.45士1.56％,20.23士1.02％,28.65士1.87％为与对照组2.80士0.35％相比,差异有显著性,且各浓度组之间差异均有显著性(p<0.01),100μmol/L PDTC作用24、48 h后的凋亡率分别为10.04士1.07％,14.45士1.56％与对照组2.80士0.15％相比,差异有显著性,,且各时间组之间差异也均有显著性(p<0.01)。3、RT-PCR和Westem-blot法分析显示,PDTC作用于MG63细胞后可降低Livin的mRNA和蛋白的表达,增加caspase-3的mRNA和蛋白的表达,呈现剂量依赖性。且Livin的表达与PDTC的作用以及骨肉瘤细胞凋亡率呈剂量负相关,与caspase-3的表达也呈剂量负相关。结论1、PDTC可明显抑制人骨肉瘤MG63细胞,并使细胞周期受到阻滞,进一步诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。抑制细胞与诱导凋亡呈剂量依赖关系。2、从Western-blotting的结果得出PDTC可使Livin表达水平降低,并使caspase-3表达水平增加。表明PDTC在促进凋亡中具有重要作用。3、在诱导MG63细胞凋亡过程中,Livin表达水平与NF-kB抑制剂PDTC的作用以及骨肉瘤细胞凋亡率呈剂量负相关,与Caspase-3的表达水平也呈负相关,提示Livin的表达可能受NF-kB活性调控,并调控其下游分子caspase-3的表达,诱导细胞凋亡。