白念珠菌是重要的条件致病性真菌之一。在机体免疫功能正常情况下,白念珠菌与其他微生物共生于人体的黏膜表面,一般不引起感染。而免疫功能低下时,白念珠菌则可造成人体浅表性感染,甚至危及生命。而且,2022年世界卫生组织最新公布的人类病原真菌预警清单将白念珠菌在内的四种真菌评定为关键优先级（Critical Priority Group）。线粒体呼吸链复合体III是参与能量代谢的关键结构之一,在真核生物的生命周期中发挥着不可或缺的作用。然而,线粒体呼吸链复合体III在白念珠菌中的功能及其与白念珠菌致病性的关联方面研究甚少。目的:探究线粒体呼吸链复合体III Qcr7亚基在白念珠菌致病过程中的功能及参与生物被膜形成的分子机制。方法:1.通过同源重组基因敲除策略,以SN152为亲本株,构建白念珠菌RIP1、COR1、QCR2、QCR6、QCR7、QCR8、QCR9和QCR10基因缺失株,命名为rip1Δ/Δ、cor1Δ/Δ、qcr2Δ/Δ、qcr6Δ/Δ、qcr7Δ/Δ、qcr8Δ/Δ、qcr9Δ/Δ及qcr10Δ/Δ;以qcr7Δ/Δ为亲本株,构建QCR7基因回补株,命名为QCR7AB;分别以bcr1Δ/Δ、brg1Δ/Δ、tec1Δ/Δ、rob1Δ/Δ1、ndt80Δ/Δ和efg1Δ/Δ株为亲本株,构建QCR7基因过表达株,分别命名为bcr1Δ/Δ+QCR7OE、brg1Δ/Δ+QCR7OE、tec1Δ/Δ+QCR7OE、rob1Δ/Δ+QCR7OE、ndt80Δ/Δ+QCR7OE和efg1Δ/Δ+QCR7OE;以qcr7Δ/Δ为亲本株,构建HWP1、YWP1、SAP6、XOG1和HYR1基因过表达株,分别命名为qcr7Δ/Δ+HWP1OE、qcr7Δ/Δ+YWP1OE、qcr7Δ/Δ+SAP6OE、qcr7Δ/Δ+XOG1OE和qcr7Δ/Δ+HYR1OE。2.采用小鼠尾静脉注射方式建立宿主系统性感染模型,通过观察小鼠生存曲线、肾脏形态、肾脏组织菌载量,以及肾脏组织病变程度和免疫细胞招募,确定Qcr7对白念珠菌致病性的影响。3.采用荧光素酶法、荧光探针DCFH-DA法和JC-1染色法分别检测WT、qcr7Δ（14）Δ和QCR7AB菌株的胞内ATP含量、活性氧水平和线粒体膜电位水平,以评价线粒体功能的变化。4.通过一系列表型实验以探索Qcr7亚基对白念珠菌致病的影响及相关分子机制:（1）分别在含不同种类碳源的YPD固体培养基上进行琼脂平板滴定实验,30℃培养48 h后观察WT、rip1Δ/Δ、cor1Δ/Δ、qcr2Δ/Δ、qcr6Δ/Δ、qcr7Δ/Δ、qcr8Δ/Δ、qcr9Δ/Δ、qcr10Δ/Δ和QCR7AB在不同碳源环境下的生长情况;（2）利用不同糖类为主要碳源环境的Spider固体培养基,37℃培养7天观察WT、qcr7Δ/Δ和QCR7AB在以上条件下菌丝生长维持的能力;（3）通过在BSA固体培养基上37℃培养48 h以观测WT、qcr7Δ/Δ和QCR7AB菌落四周的水解环情况以评定天冬氨酸蛋白酶的分泌水平;（4）通过在Spider液体培养基分别以多种不同糖类为主要碳源环境下,检测WT、qcr7Δ/Δ和QCR7AB菌丝极化生长能力;（5）在聚苯乙烯材质的九十六或十二孔板上,分别以多种糖类作为碳源的Spider液体培养基诱导生物被膜的形成,37℃培养48 h后用结晶紫染色法分析WT、qcr7Δ/Δ和QCR7AB在这些条件下的生物被膜形成情况;（6）在以甘露醇为主要碳源的Spider液体培养基中验证QCR7基因过表达对bcr1Δ/Δ、brg1Δ/Δ、rob1Δ/Δ、tec1Δ/Δ、ndt80Δ/Δ、efg1Δ/Δ生物被膜形成的影响,以及HWP1、YWP1、SAP6、XOG1、HYR1基因分别过表达对qcr7Δ/Δ生物被膜形成的影响。5.本课题组前期将白念珠菌WT和qcr7Δ/Δ定量(OD600=0.8,生长对数期)后在RPMI 1640条件下（模拟体内培养条件）培养4 h,提取RNA样本后经转录组测序。现根据转录组学测序结果,详细比较WT和qcr7Δ/Δ的差异表达基因,确定QCR7基因缺失后四类相关毒力因子（菌丝生长、细胞黏附、分泌型天冬氨酸蛋白酶和生物被膜形成）基因的变化情况,并通过RT-q PCR验证其表达,同时结合bcr1Δ/Δ、brg1Δ/Δ、rob1Δ/Δ、tec1Δ/Δ、ndt80Δ/Δ和efg1Δ/Δ中QCR7基因表达量,确定生物被膜关键转录因子调控QCR7基因表达的分子机制。结果:1.通过同源重组基因敲除方法、营养缺陷培养基筛选以及多轮PCR验证后,显示rip1Δ/Δ、cor1Δ/Δ、qcr2Δ/Δ、qcr6Δ/Δ、qcr7Δ/Δ、qcr8Δ/Δ、qcr9Δ/Δ、qcr10Δ/Δ、QCR7AB、bcr1Δ/Δ+QCR7OE、brg1Δ/Δ+QCR7OE、tec1Δ/Δ+QCR7OE、rob1Δ/Δ+QCR7OE、ndt80Δ/Δ+QCR7OE、efg1Δ/Δ+QCR7OE、qcr7Δ/Δ+HWP1OE、qcr7Δ/Δ+YWP1OE、qcr7Δ/Δ+SAP6OE、qcr7Δ/Δ+XOG1OE和qcr7Δ/Δ+HYR1OE均已构建成功。2.通过对白念珠菌复合体III各亚基缺失株在碳源利用、菌丝生长维持及生物被膜形成能力分析发现,qcr7Δ/Δ株在一系列非葡萄糖为主要碳源的环境下存在生长抑制,且在菌丝生长维持和生物被膜形成能力方面相较其它亚基缺失株受到更为显著的抑制,提示Qcr7亚基为呼吸链复合体III中的关键亚基之一。3.体内动物实验结果显示,qcr7Δ/Δ株感染组小鼠第21天仍全部存活,而WT株感染组小鼠在7天内全部死亡;且qcr7Δ/Δ株感染组小鼠的肾脏载菌量显著低于WT株感染组（P＜0.0001）,双肾重量及其与体重的比值也显著低于WT株感染组（P＜0.05）。此外,qcr7Δ/Δ株感染组小鼠的肾脏形态正常,无组织损伤及炎性细胞浸润。WT株感染组有明显的组织损伤和炎性细胞聚集,PAS染色可见大量菌丝态白念珠菌。初步说明QCR7基因缺失能够显著减弱白念珠菌对宿主的感染能力。4.为了深入确证QCR7基因在白念珠菌碳源代谢中的作用,我们比较分析了WT株、qcr7Δ/Δ株以及QCR7AB株在不同种类碳源条件下的生长及线粒体功能。结果显示QCR7基因缺失株在以Glc NAc、麦芽糖、醋酸、甘油、乙酸盐、柠檬酸盐及氨基酸为主要碳源的环境下表现出生长抑制,而在以葡萄糖、甘露醇、蔗糖为主要碳源的培养基上则表现出一定的生长缓慢。线粒体功能检测结果显示qcr7Δ/Δ株胞内ATP含量显著下降（P＜0.01）;活性氧含量则显著上升（P＜0.01）;线粒体膜电位水平相较WT株亦有一定下降,提示QCR7基因缺失可影响白念珠菌线粒体功能稳定。5.毒力因子表型实验显示:QCR7基因缺失株的菌丝生长维持能力及其在生长抑制环境中的菌丝极化能力下降、天冬氨酸蛋白酶分泌水平减少、生物被膜形成受限。这提示QCR7基因缺失可抑制白念珠菌一系列毒力因子的功能。6.通过详细对比分析WT与qcr7Δ/Δ菌株转录组测序的四类毒力因子（菌丝生长、细胞黏附、分泌型天冬氨酸蛋白酶和生物被膜形成）相关基因的表达水平,结果发现与这四类毒力因子相关的许多基因存在明显下调,其中生物被膜相关基因的数量最多（14个）且下调程度最为明显。RT-q PCR结果证实QCR7基因缺失后一系列生物被膜相关基因（SAP6、HWP1、XOG1、HYR1、YWP1、PGA7等）显著下调,提示qcr7Δ/Δ菌株致病性降低的原因可能主要归于生物被膜缺陷。此外,RT-q PCR检测进一步发现,在6个生物被膜核心转录因子缺失株（bcr1Δ/Δ、brg1Δ/Δ、tec1Δ/Δ、ndt80Δ/Δ、rob1Δ/Δ或efg1Δ/Δ）中QCR7表达均呈现下调,其中ndt80Δ/Δ株下调最显著（P＜0.0001）。7.为进一步探索Qcr7在白念珠菌生物被膜形成中的分子机制,我们在6个生物被膜核心转录因子敲除株中进行了QCR7的过表达,并评估了其对生物被膜形成的影响,结果发现过表达QCR7可以部分恢复由NDT80基因缺失带来的生物被膜形成抑制;而在qcr7Δ/Δ株中分别过表达HWP1、YWP1、XOG1或SAP6等4个细胞表面基因后可部分克服生物被膜形成的缺陷,但过表达HYR1可加重生物被膜形成的缺陷。以上结果提示Qcr7受Ndt80调控,进而影响一系列细胞表面基因参与生物被膜形成过程,最终影响白念珠菌生物被膜形成。结论:1.Qcr7是呼吸链复合体III中参与白念珠菌致病的关键亚基;2.Qcr7参与白念珠菌线粒体功能维持并对生物被膜相关基因表达有显著影响;3.Qcr7在生物被膜形成中的作用机制可能一方面受生物膜关键转录因子Ndt80调控,另一方面通过影响HWP1、YWP1、SAP6和XOG1为主的细胞表面基因表达以调控生物被膜的形成。