研究背景和目的近年来,放射性核素标记受体结合肽是肿瘤靶向诊断的研究热点之一,其中基于生长抑素受体(somatostatin receptor, SSTR)的肿瘤显像备受关注。SSTR作为G蛋白偶联受体家族的一员,共有5个亚型,即SSTR1-5,可在小细胞肺癌、神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumor, NET)、脑膜瘤及胶质瘤等多种肿瘤细胞表面高表达。基于此,越来越多的学者认为寻找对SSTR具有高亲和力的生长抑素源性配体或可为肿瘤诊断新靶点提供借鉴。奥曲肽(octreotide, OC),是天然的生长抑素经过人工修饰后合成的环八肽[D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol)],它对SSTR2有高度亲和力,对SSTR5有轻度亲和力。若3位Phe被Tyr取代,碳末端的Thr(ol)被Thr取代则奥曲肽可衍生为TATE,此衍生物对SSTR2的亲和力进一步增高,从而增加肿瘤细胞内在化的比率,最终使得肽分子在SSTR高表达组织(胰腺、肾上腺、胃、垂体以及SSTR高表达的肿瘤)中有明显高摄取。在欧美国家,111In-DTPA-otreotide (Octreoscan)是目前临床上诊断NETs的金标准,但因回旋加速器产生111In费用高,其广泛应用受限,而且与正电子核素相比,In能量较低(171 keV,245 keV),使得111In-DTPA-otreotide最终成像的空间分辨率较低。对于正电子PET显像而言,68Ga,64Cu,18F等己被用于标记奥曲肽衍生物。其中68Ga标记的奥曲肽衍生物(68Ga-DOTATATE, 68Ga-DOTATOC及68Ga-DOTANOC等)在神经内分泌肿瘤显像中具有巨大潜力,近年来在临床上使用明显增加。然而因68Ge/68Ga发生器日产量较低,每次仅可洗脱300-700MBq,再加上缺乏FDA批准的68Ga标记药物及68Ge/68Ga发生器,68Ga PET显像目前并没有在临床广泛应用。与放射性金属核素68Ga和64Cu相比,18F应用更为广泛,因其具有相对较长的半衰期(t1/2=110 min)、低能(0.64 MeV)以及缺乏散射等优良的核素特征。另外,’8F标记化合物可行延迟显像,其起始比活度较高可允许大剂量制备,且18F标记化合物空间分辨率较高,故用放射性18F标记生长抑素类似物具有更明显的优势。目前已有多种放射性18F标记的奥曲肽类似物(如2-18F-FP-OC, Gluc-Lys([18F]FP)-TOCA, Gluc-S-Dpr([18F]FBOA)TOCA以及Cel-S-Dpr([18F] FBOA)TOCA等)用于神经内分泌肿瘤的显像。但这些化合物放射性制备过程繁琐、产率较低,其临床常规使用受限,而且其制备过程很难实现自动化。近年来涌现出几种新型的18F“一步”标记法,包括氟-硅化学、氟-硼化学[16]以及氟化铝-1,4,7-三氮环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)螯合化学。其中奥曲肽衍生物TATE已被前两种方法成功标记并且显像,效果尚可。本实验采用第三种“一锅”“一步”Al18F螯合化学方法进行TATE的标记,通过A118F与NOTA复合物进行螯合形成稳定的Al18F-NOTA多肽。同时为了增加目标化合物的亲水性,我们在NOTA与TATE之间引入6个PEG,以便使得最终产物在靶组织(例如SSTR高表达的肿瘤)中的放射性摄取增加。此外我们通过体内外实验对最终产物-18F标记的NOTA-PEG6-TATE的生物学特性进行评价,并运用Micro PET显像技术在SSTR2高表达的胶质母细胞瘤中观察其前临床应用价值[18]。方法1.放射性标记NOTA-PEG6-TATE由杭州中肽生物公司合成,通过Al18F-NOTA螫合化学方法进行18F标记,在两种完全不同的反应体系中标记：乙酸盐缓冲液(pH=4)体系及乙腈反应体系。1.1基于乙酸盐缓冲液从本中心加速器获取18F离子,通过活化后的QMA柱,然后用0.2mL 0.9%的生理盐水洗脱18F离子至EP管中,然后依次往EP管中加入3μL 2 mM的AlCl3乙酸盐缓冲液(0.1 M,pH=4)以及100μL NOTA-PEG6-TATE前体溶液(0.5mg溶于0.5mL 0.5M的乙酸盐缓冲液中,pH=4)。密封后,在100。C反应20分钟。反应物的纯化在C18柱中进行,最后用分析型HPLC测定放化产率及放化纯。1.2基于乙腈反应体系从本中心加速器获取18F离子,通过活化后的QMA柱,然后用0.5mL的K2CO3/K222溶液洗脱至反应瓶中,在105℃加入0.5mL乙腈共沸除水3次,然后依次加入36μL lg/L的AICl3溶液及200μL NOTA-PEG6-TATE前体溶液(用1mL乙腈溶解0.5mg NOTA-PEG6-TATE,加30u1冰乙酸),在1050C反应20分钟,纯化方法同上。2.脂水分配系数测定取10μL (1.85MBq)的Al18F-NOTA-PEG6-TATE反应液,加入含有0.5mL正辛醇和0.5mL磷酸缓冲液(PBS)的EP管中,密封后在室温下涡旋2min,1000r/min离心5分钟。用加样枪依次取出有机相和水相各10gL置于丫计数管中,用γ计数器测定γ计数。由公式LogP=Log(计数正辛醇/计数PBS)计算标记物的平均LogP值,重复三次。3.体外稳定性实验取20μL(约3.7MBq)的Al18F-NOTA-PEG6-TATE溶液,分别置于0.5mL的PBS缓冲液(pH=7.24,0.02mol/L)或胎牛血清中,在37℃下孵育0.5,1,1.5及2 h后分别用HPLC测定其放射化学纯度,以观察其体外稳定性。但对于胎牛血清,先用等体积的乙腈稀释,密封后在室温下涡旋2min,1000r/min条件下离心5min,取上清液用HPLC进行分析。4.细胞培养及瘤鼠模型的建立人胶质母细胞瘤U87MG细胞在37℃、5%CO2的培养箱中培养,培养基为含有10%胎牛血清、青霉素(100 IU/mL)及链霉素(100 IU/mL)的MEM培养液,隔天更换培养介质。当细胞铺满培养皿后用0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA和0.01mol/LPBS液(pH7.4)分离用于进一步细胞培养。在每只雄性裸鼠右肩部皮下接种5×106个U87MG细胞,待肿瘤直径达到0.8-1 cm时用于体内MicroPET实验(大约种植后4-5周),所有动物实验遵循国家标准及动物福利原则。5.细胞摄取及流出实验在24孔板中每孔加入1×105个U87MG细胞,培养过夜以保证其贴壁,隔天去除培养基,每孔加入0.5mL含185 KBq Al18F-NOTA-PEG6-TATE的无血清培养液,在37℃孵育10,30,60,90及180 min后每孔用0.5mL冰冻的PBS洗涤3遍,然后用0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA消化细胞,收集细胞悬液用Y计数仪测量计数。细胞摄取数据经衰变校正后用细胞结合力,即百分加入剂量表示,实验设3个平行样,重复两次。对于细胞流出实验,在24孔板中加入每孔1×105个U87MG肿瘤细胞,在37℃与185 KBq/孔Al18F-NOTA-PEG6-TATE共孵育2h使其充分内在化。然后去除培养基,用冰冻PBS冲洗3遍,再加入无血清培养液在37℃孵育0,15,30,60,90及120 min。之后再用冰冻PBS液冲洗3遍,最后用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化细胞,收集细胞悬液用γ计数仪测量计数。细胞排泄数据经衰变校正后用细胞滞留率即百分加入剂量表示,实验设3个平行样,重复两次。6.体内生物学分布实验在2%异氟烷麻醉下每只荷U87MG瘤鼠通过尾静脉注射3.7MBq(100μCi)的Al18F-NOTA-PEG6-TATE,阻断实验是通过尾静脉共同注射上述示踪剂及前体溶液NOTA-PEG6-TATE (10 mg/kg)。在注射显像剂后1h处死动物,分离肿瘤及主要脏器并称重,然后用γ计数仪测量放射性计数。我们用每克组织百分注射剂量(%ID/g)来表示肿瘤和正常脏器的放射性摄取。7. Micro PET显像实验组荷U87MG瘤鼠在2%异氟烷麻醉下经尾静脉注射100μL约3.7MBq(100μCi)的Al18F-NOTA-PEG6-TATE,在注射显像剂60min及120min后采集静态图像。阻断组是通过尾静脉共注射显像剂3.7MBq(100μCi)及10mg/kg的前体溶液NOTA-PEG6-TATE,在注射显像剂60min后采集静态图像。在衰减校正后的全身冠状位图像上勾画肿瘤及主要脏器的感兴趣区,测量放射性摄取值,用%ID/g表示,PET显像结束后将动物处死,遵循动物福利原则。8.免疫组化显像结束后,将荷U87MG瘤鼠断颈处死,将瘤结节解剖出来,固定、包埋,并进行SSTR2抗体的免疫染色。同时,用非神经内分泌肿瘤-人口腔上皮癌细胞株KB瘤结节进行阴性对照。9.统计分析统计学分析采用SPSS 20.0进行处理,统计结果用均数±标准差表示,p<0.05具有统计学意义。结果1.放射性标记整个放射性标记过程在100-105’C 60min之内完成,衰减校正后基于乙酸盐反应体系的标记率介于70%-100%之间,基于乙腈反应体系的标记率介于64%-74%之间。采用Sep-Pak C18分离柱纯化、HPLC检测后,无论基于哪种反应体系,放纯度均大于98%,比活度大于16.9GBq/umol。2.脂水分配系数测定脂水分配系数实验是为了测量Al18F-NOTA-PEG6-TATE的亲水性程度,经实验测定Al18F-NOTA-PEG6-TATE的Log P=-2.45±0.38,表明此分子探针具有明显亲水性。3.体外稳定性实验Al18F-NOTA-PEG6-TATE分子探针在37 ℃ PBS缓冲液中孵育2h放化纯仍大于95%,同时在胎牛血清中孵育2h放化纯大于80%,说明Al18F-NOTA-PEG6-TATE在体外大部分是稳定存在的。4.细胞摄取及流出实验Al18F-NOTA-PEG6-TATE能快速、高效的与U87MG细胞结合,而且随着孵育时间的延长,其对U87MG的细胞结合力进一步增强,在孵育3h时达到高峰,细胞结合力最高值为1.77%±0.07%。本实验中细胞结合力未区分细胞表面结合率及内在化比率。在细胞流出实验中,在最初的10min内,Al18F-NOTA-PEG6-TATE在U87MG细胞内流出最快,细胞滞留率从1.35%±0.10%降至0.41%±0.01%,之后此显像剂在U87MG细胞内流出缓慢,2h末细胞滞留率为0.29%±0.07%。5.体内生物学分布实验体内生物学实验结果表明注射Al18F-NOTA-PEG6-TATE 1h后U87MG肿瘤摄取值为(2.43±0.40)%ID/g,显著高于脑、心脏、肺脏、肝脏、血液及肌肉等正常脏器。显像剂在双肾摄取较高,高达(4.13±0.92)%ID/g,而肝脏、胃肠摄取较低,说明Al18F-NOTA-PEG6-TATE是通过泌尿系排泄,而非肝胆排泄。另外在SSTR高表达的胰腺、胃、肾上腺内可见明显生理性摄取,尤其是肾上腺,摄取值分别为(1.06±0.19)%ID/g、(1.62±0.25)%ID/g及(3.88±0.88)%ID/g,提示Al18F-NOTA-PEG6-TATE与生长抑素受体有较高亲和力。骨中摄取明显增高,高达(67.18±10.78)%ID/g,并且在阻断中摄取值未见明显下降,说明Al18F-NOTA-PEG6-TATE在体内易发生脱氟现像。阻断实验显示肿瘤、胰腺、胃及肾上腺对Al18F-NOTA-PEG6-TATE的特异性摄取在大量非放射性前体的存在下可明显减低,进一步证明Al18F-NOTA-PEG6-TATE与生长抑素受体有高亲和力。6. Micro PET显像通过Micro PET/CT显像分析Al18F-NOTA-PEG6-TATE在荷U87MG瘤鼠体内的药代动力学特性及肿瘤靶向特征。此示踪剂通过泌尿系排泄,U87MG瘤结节在Micro PET图像上显示清晰,在注射显像剂1小时及2小时后瘤组织的摄取值分别为(3.8±0.3)及(4.4±0.4)%ID/g。在过量非放射性前体的存在下,肿瘤摄取值明显下降,近乎于背景, 降至(0.334±0.06)%ID/g, 证实了Al18F-NOTA-PEG6-TATE对SSTR阳性的U87MG瘤组织有明显的SSTR靶向性。另外肝脏及肌肉摄取较低。与体内分布实验相似,Micro PET显像也显示A118F-NOTA-PEG6-TATE在体内发生了脱氟现象。正常组中股骨摄取值较高为(14.4±2.7)%ID/g,且在阻断组中未见明显下降,约(14.4±1.8)%ID/g,说明骨中的高摄取是脱氟现象,而非SSTR高表达。7.免疫组化免疫组化结果显示SSTR2在U87MG肿瘤细胞表面高表达,在KB肿瘤细胞低表达,这与Micro PET显像结果一致,说明肿瘤组织摄取Al18F-NOTA-PEG6-TATE不是因为非特异性摄取,而是肿瘤细胞表面SSTR2呈高表达所致。结论NOTA-PEG6-TATE可成功制备并能通过Al18F-NOTA螯合化学方法成功进行18F标记,此Al18F-NOTA螯合化学方法简便、省时,可通过“一锅法”标记完成,放化产率优于传统的辅基标记法。体内外实验证明示踪剂Al18F-NOTA-PEG6-TATE有良好的体外稳定性及肿瘤显像特性(如：肿瘤靶向性、快速血浆清除及肾脏排泄等)。因此,可初步认为Al18F-NOTA-PEG6-TATE是良好的监测神经内分泌肿瘤的正电子显影剂。Al18F-NOTA-PEG6-TATE制备过程简单,体内显像效果尚可,但因存在脱氟现象,故进一步优化此探针及放射性氟标策略具有积极意义,为将来加速18F标记生长抑素类似物的临床转化过程提供参考。