海洋两栖性无脊椎动物瘤背石磺在中国沿海较易获取,且中枢神经系统易分离,是一种优良的动物模型。高等脊椎动物的神经系统较软体动物的神经系统更为复杂精细,在神经研究上也较简单无脊椎动物更困难,故研究者常用软体动物加州海兔作为神经基础研究材料,但加州海兔在中国本土基本不能获取,需选择一种合适的软体动物替代。海洋两栖性无脊椎动物瘤背石磺在中国沿海较易获取,且中枢神经系统易分离,是一种优良的动物模型,且其生活在环境多变的潮间带,具有多种生物节律,是研究生物节律和长期记忆相关性的良好材料。在本实验室前期研究基础上,以四种石磺为实验材料,通过形态分析和分子实验分析选择瘤背石磺为最适宜的实验对象,选取瘤背石磺神经节为研究材料,对石磺的学习记忆能力和生物节律性进行初步探讨,旨在开发一种中国的地方性神经模式种为研究学习记忆能力提供便利,也为研究潮间带生物节律提供了一个良好的模型。本文主要通过行为学测定、石磺神经各时期的目的基因表达、目的基因的原位杂交技术对石磺学习记忆能力和生物节律性进行初步探索。1.蛋白质的合成对瘤背石磺长期记忆的影响瘤背石磺背部在受到外界电刺激时,其外套膜边缘上翘,同时外套膜上的颗粒腺分泌深棕色液体,并伴有刺激性气味。将这一系列的防御行为命名为“外套膜上翘反应(Mantle-upturned Reflex,MUR)”,并以这一行为的反应程度作为衡量记忆程度的指标。瘤背石磺通过一系列电刺激训练,表现出逐步强烈的外套膜上翘反应,从而获得稳定的长期记忆。在不同训练时间段抑制石磺神经的蛋白质合成,发现在长期记忆形成阶段,抑制蛋白质合成只影响瘤背石磺一段时间内的记忆形成,但不影响24小时后通过正常训练再次形成的长期记忆;同时也发现了蛋白质合成在记忆再巩固阶段的重要性。2.瘤背石磺OnCREB1和OnCREB2基因的克隆及定位定量分析本实验从神经节转录组数据库中鉴定得到与长期记忆形成相关的两个环磷腺苷效应元件结合蛋白亚型基因的部分序列,通过RT-PCR和RACE法获得这两个基因的全长,命名为OnCREB1和OnCREB2。OnCREB1基因全长2426 bp,包括3’非翻译区(3’UTR)255 bp,5’非编码区(5’UTR)1360 bp,开放阅读框813 bp,共编码270个氨基酸。该蛋白包括C端的亮氨酸拉链结构域(BZIP)和N端的激酶诱导结构域(KID):BZIP主要结合DNA,预测该蛋白第164位的赖氨酸为结合位点;软件预测KID功能区的Ser-85和Ser-94可被磷酸化,从而激活由OnCREB1基因编码的蛋白质的转录活性。OnCREB2基因全长3859 bp,包括3’非翻译区(3’UTR)593 bp,5’非编码区(5’UTR)2108 bp,开放阅读框1158 bp,共编码385个氨基酸。OnCREB2蛋白二聚体形式主要是在亚基间氢键作用力和5对亮氨酸残基疏水作用下形成,该蛋白只含有C端的亮氨酸拉链结构域,并不存在可被磷酸化的位点,故预测OnCREB2编码的蛋白只能结合下游DNA,但推测其并不具有转录活性。qRT-PCR检测石磺神经节在“对照组”以及“训练组”的OnCREB1和OnCREB2基因的表达量,结果显示OnCREB1在已经形成长期记忆的“训练组”表达量远高于不能对刺激形成长期记忆的实验组,OnCREB2在训练后表达量虽有上升但不明显,表明OnCREB1编码的蛋白在长期记忆形成的过程中发挥重要的作用。同时,本实验通过原位杂交技术检测OnCREB1和OnCREB2基因在瘤背石磺神经节中动态分布情况。瘤背石磺在未进行训练前,OnCREB1主要分布在足神经节和侧神经节;经过训练后,OnCREB1不仅在足神经节和侧神经节中表达,而且OnCREB1信号还出现在脑神经节中,在脏神经节中的信号也有所加强。同样,OnCREB2信号起初只出现在未训练石磺神经中侧神经节和足神经节区域里,而经过训练后石磺的所有神经节均出现OnCREB2信号。OnCREB基因动态分布过程说明记忆形成是神经节之间相互的联系,而不局限单个神经节或者单个神经元细胞。3.瘤背石磺学习记忆能力与生物节律性的相关性测定不同时间段下瘤背石磺在光照-黑暗(LD)和持续黑暗(DD)的环境中学习和记忆的行为学差异,结果表明瘤背石磺属于夜行性动物,在夜间受到刺激并作出防御反应的觉醒阈值更低。另有研究表明,LD周期可以掩蔽潮间带动物行为上的潮汐节律性,从而只表现昼夜节律性。瘤背石磺在一天中的不同时间段学习能力不同,导致学习获取量不同,在LD和DD环境中的学习获取量也有区别,由此表明学习获取量是受昼夜节律和LD掩蔽效应调控。而不同时间段的长期记忆形成的趋势图和学习获取量的趋势图近乎相似,故推测长期记忆的形成程度是由石磺最初的学习所获得记忆量所决定的。同时,本实验测定了与长期记忆形成有关的OnCREB1基因和与昼夜节律相关的per2基因及与月节律和潮汐节律相关的cry基因在瘤背石磺一天各时间段中的表达量趋势。Per2在LD和DD中的24点(ZT18和CT18)的表达量都到达一个峰值。在LD条件下,潮汐节律受到LD周期的掩蔽,cry的表达模式没有规律性,OnCREB1基因的表达模式图和per 2基因基本一致;在DD条件下,OnCREB1表达模式图存在两个峰,分别与per2和cry的峰一致。由此,在分子水平上可以得出长期记忆的形成具有生物节律性,且其在形成的过程中极易受到LD周期掩蔽的影响。