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内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)与脑缺血再灌注损伤密切相关,过强或持续时间过长的ERS可以引起细胞凋亡。缺血后处理(ischemic postconditioning)是指组织器官发生缺血后,在长时间的再灌注之前进行数次反复、短暂的再灌注/缺血处理,调动机体内源性的保护机制以减轻组织再灌注损伤的处理措施。近年来,缺血后处理的神经保护作用已经被证实。缺血后处理在缺血后施行,可操作性大,具有很大的实用价值和临床应用前景。目前对缺血后处理机制的研究不多,缺血后处理保护脑缺血再灌注损伤具体机制尚不明确。本课题拟应用大鼠永久性局灶性脑缺血模型,观察缺血后处理对大鼠脑缺血/再灌注(I/R)损伤的影响,探讨缺血后处理脑保护作用是否跟减弱ERS有关,并进一步研究PI3K-Akt信号通路是否介导这一作用。从而为临床治疗脑缺血/再灌注损伤提供可靠的实验依据和理论基础。本课题研究内容分为三部分:1缺血后处理保护脑缺血再灌注损伤的研究。2缺血后处理通过抑制ERS减轻脑缺血再灌注损伤。3缺血后处理通过调节PI3K-Akt通路抑制ERS诱导的凋亡。第一章:缺血后处理保护脑缺血再灌注损伤的研究目的:建立大鼠永久性局造性脑缺血模型,观察缺血后处理对大鼠缺血再灌注损伤的脑保护作用。方法:健康雄性SD大鼠,体重350-450 g。随机分为三组:假手术(Sham)组,缺血再灌注(I/R)组,缺血后处理(Postcond)组。电凝法进行左侧大脑中动脉永久性阻断,缺血再灌注模型为pMCAO+双侧颈总动脉夹闭30 min。双侧颈总动脉阻断30 min后松开,造成脑缺血再灌注,后立即实施缺血后处理即松开双侧颈总动脉夹30s,后夹闭双侧颈总动脉10s,连续重复三次此过程。各组在缺血前20min,缺血20 min及再灌注20 min分别记录PH值、动脉血二氧化碳分压(PC02)、动脉血氧分压(P02)。缺血再灌注后24 h,用神经评分法测定神经行为缺失,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride, TTC)法测定大鼠脑梗塞面积。结果:各组或同组不同时间点PH值、动脉血二氧化碳分压(PC02)、动脉血氧分压(P02)差异无统计学意义(P>0.05)。与I/R组相比,再灌注24 h Postcond组能明显改善大鼠神经功能(P<0.05),明显减少脑梗塞面积(P<0.05)。结论:缺血后处理能明显减少脑梗塞面积,产生神经保护效应。第二章:缺血后处理通过抑制内质网应激减轻脑缺血再灌注损伤目的:建立大鼠永久性局造性脑缺血模型,观察缺血后处理对内质网应激蛋白的影响,研究缺血后处理新的脑保护机制。方法:健康雄性SD大鼠,体重350-450g。随机分为三组:假手术(Sham)组,缺血再灌注(I/R)组,缺血后处理(Postcond)组。电凝法进行左侧大脑中动脉永久性阻断,缺血再灌注模型为pMCAO+双侧颈总动脉夹闭30 min。双侧颈总动脉阻断30 min后松开,造成脑缺血再灌注,后立即实施缺血后处理即松开双侧颈总动脉夹30s,后夹闭双侧颈总动脉10s,连续重复三次此过程。分别在再灌注6h、12h、24h取大鼠缺血侧半影区大脑皮层,免疫组化法和Western Blot法检测缺血侧大脑皮层GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表达,原位末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated Biotin-dUTP niek-end labeling, TUNEL)法检测神经细胞凋亡。结果:与I/R,再灌注24 h Postcond明显减少凋亡分子CHOP和caspase-12阳性细胞表达,再灌注12h和24h Postcond明显增加GRP78蛋白阳性细胞表达(P<0.05)。与Sham组比较,再灌注6hCHOP、caspase-12、GRP78蛋白表达开始增加,再灌注24 h达高峰(P<0.05)。与I/R组比较,再灌注24h Postcond明显减少凋亡分子CHOP、cleaved-caspase-12表达(P<0.05),再灌注12 h、24 h Postcond明显增加GRP78蛋白的表达(P<0.05)。Sham组大脑皮层中未见明显凋亡细胞。I/R组,再灌注6h神经细胞凋亡增加,再灌注12h凋亡细胞逐渐增加,再灌注24h达到高峰。与I/R组相比,再灌注24h Postcond明显减少神经细胞凋亡(P<0.05)。结论:脑缺血再灌注损伤诱发内质网应激(ERS)。缺血后处理下调凋亡分子CHOP、caspase-12表达,上调GPR78蛋白表达,抑制ERS诱导的细胞凋亡,减轻脑缺血再灌注损伤。第三章缺血后处理通过调节PI3K-Akt通路抑制内质网应激诱导的凋亡目的:建立大鼠永久性局造性脑缺血模型,观察PI3K-Akt信号通路在缺血后处理抑制内质网应激诱导的细胞凋亡的作用。方法:健康雄性SD大鼠,体重350-450g。随机分为四组:假手术(Sham)组,缺血再灌注(I/R)组,缺血后处理(Postcond+DMSO)组,缺血后处理+PI3K特异性抑制剂LY294002 (Postcond+LY294002)组。电凝法进行左侧大脑中动脉永久性阻断,缺血再灌注模型为pMCAO+双侧颈总动脉夹闭30min。双侧颈总动脉阻断30min后松开,造成脑缺血再灌注,后立即实施缺血后处理即松开双侧颈总动脉夹30s,后夹闭双侧颈总动脉10s,连续重复三次此过程。LY294002溶于DMSO,10μl,10 mM,于后处理前15分钟侧脑室给药。用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride, TTC)法测定大鼠脑梗死面积。再灌注24h取大鼠缺血侧半影区大脑皮层,免疫组织化法和Western Blot法检测缺血侧半影区大脑皮层GRP78、CHOP、caspase-12、P-Akt(Ser473)蛋白表达变化,原位末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated Biotin-dUTP niek-end labeling, TUNEL)法检测神经细胞凋亡。结果:与I/R组相比,Postcond明显减轻脑梗塞面积,给予特异性抑制剂LY294002后,部分拮抗Postcond的脑保护作用(P<0.05)。与Sham组比较,I/R组CHOP、caspase-12、GRP78蛋白表达增高(P<0.05)。与I/R组比较,Postcond明显减低CHOP、caspase-12蛋白表达,明显增高GRP78、P-Akt蛋白表达。与Postcond+DMSO组比较,预先给予抑制剂LY294002后,CHOP、caspase-12蛋白表达明显增高,GRP78、P-Akt蛋白表达明显减少。Sham组大脑皮质未见明显凋亡细胞。与Sham组比较,I/R组CHOP、caspase-12、GRP78阳性细胞及神经凋亡细胞明显增多(P<0.05)。与I/R组相比,Postcond明显减少CHOP、caspase-12阳性细胞和神经凋亡细胞,明显增加GRP78阳性细胞(P<0.05)。与Postcond+DMSO组相比,预先给予抑制剂LY294002,CHOP、caspase-12(?)日性细胞及神经凋亡细胞明显增加,GRP78阳性细胞明显减少(P<0.05)。结论:缺血后处理通过减弱内质网应激反应减少脑缺血再灌注损伤造成的神经细胞凋亡,发挥脑保护作用。其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。