本研究以家蚕(大造)为材料,以家蚕脂肪体cDNA为模板克隆家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin4)基因;用脂多糖(LPS)刺激5龄3天家蚕后分时间段取其血淋巴和脂肪体,再以其cDNA为模板做荧光定量PCR分析。采用大肠杆菌原核表达系统进行家蚕serpin4基因的体外表达研究,并纯化Serpin4融合蛋白,以纯化的融合蛋白作为抗原免疫昆明鼠制备了多克隆抗体。主要研究结果如下:1.提取5龄3天大造家蚕脂肪体mRNA,参照文献设计引物,采用RT-PCR方法扩增去除信号肽的家蚕serpin4基因(GenBank登录号:GU270470)。
　　序列分析表明,去信号肽家蚕serpin4基因编码区长度为1183 bp,编码393个氨基酸,成熟蛋白质的分子量约为44.5 kDa。2.根据获得的家蚕serpin4基因序列,设计一对引物,进行荧光定量PCR反应。以5龄3天大造家蚕幼虫进行LPS免疫刺激前、后不同时间段脂肪体和血淋巴cDNA为模板进行RT-PCR, PCR扩增产物预期大小为268bp,以家蚕Actin3基因为内参(Sense(F):5’CTGCGTCTGGACTTGGC3’Antisense(R):3’ CGAGGGAGCTGCTGGAT5’),采用Actin3做内参对定量结果进行归一化处理,最后得到这个基因的不同时间段的相对倍数,相对倍数采用处理组的相对表达量除以同一时间段对照组的相对表达量。
　　结果表明,serpin4基因mRNA转录水平在家蚕血淋巴中经诱导后6 h~12h呈先下降后上升的趋势。诱导后serpin4基因mRNA在家蚕脂肪体中的转录情况却没有明显变化。由此推测,家蚕serpin4基因参与家蚕部分先天免疫反应。3.将去掉信号肽的家蚕serpin4基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经1 mmol/L IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析,结果表明家蚕serpin4基因以融合蛋白形式表达,经IPTG诱导转化去信号肽家蚕serpin4的BL21菌与对照BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21菌和非诱导转化去信号肽家蚕serpin4的BL21菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带,相对分子量约45kDa,初步证明家蚕Serpin4在大肠杆菌中得到表达。经Western blot分析,表明在约45kDa大小位置出现较明显的条带,与推导的融合蛋白分子量相符。而对照BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21菌和非诱导转化家蚕serpin4的BL21菌都没有检测到条带,进一步证明了去信号肽家蚕serpin4在大肠杆菌中成功表达。4.大量诱导Serpin4融合蛋白表达后进行回收纯化,将纯化蛋白作为抗原免疫刺激昆明鼠,四次免疫后取鼠血清获得相应多克隆抗体。采用Western blot分析特异性,Elisa检测多克隆抗体效价达到1:20000。家蚕serpin4基因克隆、LPS刺激后在不同时间段的定量表达,原核表达以及多克隆抗体的制备等研究为进一步从分子和蛋白水平上解析Serpin于家蚕生理中的功能打下了基础。