【摘 要】
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油橄榄（Olea europaea L.）属木犀科（Oleaceae）木犀榄属（Olea）常绿乔木,是世界上著名的“四大木本油料植物”之一。由橄榄果实冷榨得到的橄榄油不仅富含单不饱和脂肪酸,还含萜类、角鲨烯等次生代谢产物。其中,萜类化合物是影响橄榄油品质和口感的重要组分,还具有抗菌、消炎、预防癌症等药用价值。油橄榄叶片中含有大量的橄榄苦苷,被广泛用于化妆品行业和医药领域,具有重要的市场应用价值。植
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油橄榄（Olea europaea L.）属木犀科（Oleaceae）木犀榄属（Olea）常绿乔木,是世界上著名的“四大木本油料植物”之一。由橄榄果实冷榨得到的橄榄油不仅富含单不饱和脂肪酸,还含萜类、角鲨烯等次生代谢产物。其中,萜类化合物是影响橄榄油品质和口感的重要组分,还具有抗菌、消炎、预防癌症等药用价值。油橄榄叶片中含有大量的橄榄苦苷,被广泛用于化妆品行业和医药领域,具有重要的市场应用价值。植物萜类合成代谢途径有两种,分别为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径和甲羟戊酸（MVA）途径。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）和1-去氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）分别是MEP途径的关键酶和限速酶。目前,关于油橄榄中DXS和DXR基因鲜有报道。因此,本研究以油橄榄为材料,克隆DXS和DXR基因家族,并使用颜色互补反应进行功能验证;为了揭示Oe DXS和Oe DXR在油橄榄不同组织中的转录水平的差异,采用实时荧光定量PCR技术对油橄榄不同组织中Oe DXS和Oe DXR家族的表达量进行分析。为进一步提高油橄榄的萜类含量及改良油橄榄品种奠定基础。主要研究结果如下:（1）从油橄榄中克隆得到2个DXS基因和2个DXR基因,分别命名为Oe DXS1、Oe DXS2、Oe DXR1和Oe DXR2。生物信息学分析结果表明,这4个基因的开放阅读框（ORF）的长度分别为2172bp、2139bp、1425bp和1425bp,编码723、712、474和474个氨基酸;4个蛋白分子质量分别为178.00KDa、76.811KDa、51.34KDa和51.576KDa;蛋白的理论等电点（p I）分别为4.94、7.14、5.87和5.70;分别属于不稳定蛋白、稳定蛋白、不稳定蛋白和稳定蛋白。Oe DXS1、Oe DXS2、Oe DXR1、Oe DXR2蛋白均无跨膜蛋白,都不含信号肽;序列比对结果表明,Oe DXS1/Oe DXS2和Oe DXR1/Oe DXR2蛋白的氨基酸序列与多种植物的DXS和DXR氨基酸序列的相似性达到80%以上。Oe DXS1、Oe DXS2蛋白都具有嘧啶结合基序、TPP结合域和转酮醇酶C末端基序。Oe DXR1、Oe DXR2蛋白均含有NADPH结合模序、底物DOXP结合的保守序列以及N端富含脯氨酸的高度保守序列。系统进化树分析表明,Oe DXS1属于I型DXS,Oe DXS2被聚为II型DXS;Oe DXR1与桂花DXR聚类在同一进化分支上,表明其亲缘关系较近,与传统分类系统一致,而Oe DXR2单独为一个进化分支。（2）成功构建大肠杆菌表达载体p Trc、p Trc-Oe DXS1、p Trc-Oe DXS2、p TrcOe DXR1、p Trc-Oe DXR2,并转化至含有p AC-BETA质粒的大肠杆菌中,以TOP10、TOP10+p Trc-Oe DXS1/Oe DXS/Oe DXR1/Oe DXR2、TOP10+p AC-BETA、TOP10+p Trc+p AC-BETA菌种为对照,将5种不同的菌种划线于双抗平板,采用颜色互补反应进行功能验证,结果表明:含有p Trc-Oe DXS1/Oe DXS2/Oe DXR1/Oe DXR2-p AC-BETA双质粒的菌斑颜色深于对照组TOP10+p Trc+p AC-BETA的菌斑颜色,其它三种对照组菌种不能在双抗平板生长,表明Oe DXS1/2和Oe DXR1/2基因在大肠杆菌的表达增强了大肠杆菌β-胡萝卜素的生成。因此,Oe DXS1/2和Oe DXR1/2基因具有催化功能。（3）以油橄榄β-actin为内参基因,采用q RT-PCR技术检测Oe DXS1/2和Oe DXR1/2在油橄榄根、茎、叶、花、果中的表达量,结果表明:这4个基因在根、茎、叶、花、果中的表达各有差异,在叶中的表达量均高于其它组;采用微波辅助提取法提取不同组织中的橄榄苦苷,并用HPLC进行含量测定,结果表明,叶中的橄榄苦苷含量最高,其次是果,其它组织中的含量相对较少;分析橄榄苦苷与Oe DXS1/Oe DXS2/Oe DXR1/Oe DXR2基因表达量的相关性发现,橄榄苦苷含量与这4个基因的表达量均呈现显著相关性。
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