黄芎方（Huangxiong Formula,HXF;黄芎抗栓胶囊,原名:通脑精胶囊）是安徽中医药大学第一附属医院的院内制剂,由大黄、川芎、郁金、石菖蒲组成,具有行气化痰、活血解毒的功效,可通过改善缺血和缺氧导致的神经功能损伤及炎症损伤,从而更好的保护大脑。缺血性脑卒中（Ischemic Stroke,IS）指由于大脑供血动脉狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的一类疾病。溶栓是临床治疗IS的主要策略之一,但溶栓治疗时间窗狭窄和出血的风险而具有一定局限性。由于IS病理学的复杂性,寻找积极有效的治疗方法非常重要。HXF对IS具有治疗,然而其作用机制尚不明确。中医药具有多成分、多靶点、多途径作用特色,在防治脑卒中和卒中后恢复等方面的应用历史悠久。网络药理学是一种从系统水平预测复方有效成分及疾病靶点,建立药物-成分-靶点-疾病的多层次网络,锁定药物与疾病相互关联的关键靶点,利用生物信息学分析,阐述中药及复方发挥疗效作用机制的有效方法。本课题旨在通过网络药理学和体内外实验验证的方法,探讨HXF治疗IS的作用机制,为制剂的进一步开发提供依据。目的:利用网络药理学、分子对接、药物亲和力反应靶点稳定性（drug affinity responsive target stability,DARTS）、细胞热迁移实验（cellular thermal shift assay,CETSA）与体内外实验相结合的方法,探讨HXF治疗IS的作用机制,为其临床应用提供科学依据。方法1.HXF治疗IS作用机制的网络药理学研究（1）利用中药系统药理数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）和文献获取HXF主要活性成分,通过Swiss Target Prediction数据平台检索相应的成分靶点。（2）在Genecards、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、Therapeutic Target Database（TTD）和Dis Ge NET获得IS的相关靶点。（3）利用Venny2.1.0进行HXF和IS交集靶点分析。（4）采用Cytoscape3.9.0软件进行活性中药-成分-靶点网络构建。（5）通过STRING数据库构建潜在作用靶点的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络,并利用Cytoscape 3.9.0软件进行拓扑分析筛选关键靶点。（6）采用DAVID数据库对关键靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。（7）采用Cytoscape3.9.0软件进行成分-靶点-通路网络构建。2.HXF对I/R大鼠的保护作用及靶点、通路验证（1）采用改良线栓法建立大鼠脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）模型,并进行神经行为学评分。（2）采用TTC染色法检测各组大鼠脑梗死体积。（3）脑指数观察大鼠的脑水肿。（4）H＆E染色法和尼氏（Nissl）染色检测各组大鼠脑组织病理形态学变化。（5）Real-Time PCR技术检测脑组织中核心基因m RNA的表达。（6）Western blot检测各组脑组织中PI3K/AKT通路蛋白的表达。3.HXF含药脑脊液（Huangxiong Formula-cerebrospinal fluid,HXF-CSF）对OGD/R损伤HT22细胞的保护作用（1）氧糖剥夺再灌注（Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion,OGD/R）建立I/R体外模型。（2）采用CCK8法筛选HXF-CSF对HT22细胞的安全浓度以及OGD/R损伤后HT22细胞的存活率。（3）比色法检测OGD/R损伤后HT22细胞后细胞LDH释放量。（4）倒置显微镜观察HT22细胞形态学变化。（5）采用DCFH-DA荧光探针染色法及流式细胞术检测HXF-CSF对OGD/R损伤HT22细胞后ROS生成变化的影响。（6）WST-8法检测细胞内SOD活性。（7）TBA法检测细胞内MDA的水平。（8）采用流式细胞术检测HXF-CSF对OGD/R损伤HT22细胞后Ca2+的影响。（9）Hoechst 33258染色观察各组HT22细胞凋亡情况。（10）流式细胞术检测HT22细胞凋亡率。（11）Western blot检测PI3K/AKT通路蛋白的表达。4.HXF中α-细辛醚成分对OGD/R损伤HT22细胞的保护作用验证（1）采用超高效液相（Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC）检测HXF中的成分。（2）OGD/R建立I/R体外模型;（3）采用CCK8法筛选α-细辛醚对HT22细胞的安全浓度和OGD/R损伤后HT22细胞的存活率。（4）比色法检测OGD/R损伤HT22细胞后各组细胞的LDH释放量。（5）倒置显微镜观察HT22细胞形态学变化。（6）采用DCFH-DA荧光探针染色法检测α-细辛醚对OGD/R伤HT22细胞ROS生成的影响。（7）WST-8法检测细胞内SOD活性。（8）TBA法检测细胞内MDA的水平。（9）Hoechst 33258染色观察各组HT22细胞凋亡情况。（10）流式细胞术检测HT22细胞凋亡率。（11）Western blot检测PI3K/AKT通路蛋白的表达。（12）RT-PCR检测各组细胞中Bax和Bcl-2的m RNA表达量。（13）采用分子对接、DARTS和CETSA,以验证α-细辛醚是否与PI3K结合。结果1.HXF治疗IS作用机制的网络药理学研究（1）共筛选出HXF的有效活性成分44个,成分靶点795个,IS靶点2244个,HXF和IS交集靶点317个。（2）PPI网络拓扑分析,根据度值（Degree）、接近中心性（Closeness Centrality）、介度中心性（Betweenness Centrality）筛选出72个关键靶点。（3）GO富集分析表明,HXF治疗IS与包括对细胞凋亡的负向调节和对细胞增殖和凋亡的正向调节等生物学过程相关。（4）KEGG通路分析显示,主要涉及包括PI3K/AKT信号通路、甲状腺素信号通路和HIF-1信号通路等。（5）成分-靶点-通路网络表明,柚皮素、山奈酚、α-细辛醚等成分可能是HXF的潜在活性成分。2.HXF对I/R大鼠的保护作用及靶点、通路验证（1）HXF能显著降低I/R大鼠的神经行为学评分和脑梗死体积。（2）HXF能显著降低脑指数。（3）HXF能显著改善I/R大鼠脑组织病理形态学损伤。（4）RT-PCR结果显示,与模型组相比,HXF能明显下调SRC、TP53、STAT3和CTNNB1的m RNA表达量,上调AKT1、MAPK3、HRAS、EGFR、VEGFA和PIK3R1的表达量。（5）Western Blot结果显示,与模型组相比,HXF各剂量给药组增加I/R损伤诱导的p-PI3K、p-AKT和Bcl-2的表达,降低Bax和cleaved-caspase9的表达。3.HXF-CSF对OGD/R损伤HT22细胞的保护作用（1）根据CCK8结果,选择HXF-CSF 20%浓度组为后续实验最适浓度。（2）倒置显微镜观察细胞,OGD/R组HT22细胞皱缩、细胞突触变短、贴壁差、易漂浮,而HXF-CSF给药组细胞形态均一,细胞脱落较少,贴壁细胞较多。（3）与OGD/R组相比,HXF-CSF中MDA、ROS和Ca2+显著降低,SOD活性升高。（4）Hoechst染色结果和AV/PI流式结果显示,HXF-CSF减轻OGD/R诱导的细胞凋亡。（5）Western Blot结果显示,与模型组相比,HXF-CSF增加I/R损伤的p-PI3K、p-AKT和Bcl-2的表达,降低Bax和cleaved-caspase9的表达。4.HXF中α-细辛醚成分对OGD/R损伤HT22细胞的保护作用及机制验证（1）UPLC检测到HXF中的6种活性成分,α-细辛醚（α-Asarone）、阿魏酸（FER）、洋川芎内酯I（senkyunolide I）、大黄酸（rhein）、β-细辛醚（β-Asarone）、大黄素甲醚（physcion）。（2）网络药理学和UPLC分析结果表明,α-细辛醚可能是HXF中一个重要成分。（3）根据CCK8结果,选择α-细辛醚（5n M,10n M,20n M）浓度组为后续实验低中高剂量。（4）倒置显微镜观察细胞,OGD/R组HT22细胞皱缩、细胞突触变短、贴壁差、易漂浮,而α-细辛醚组细胞形态均一,细胞脱落较少,贴壁细胞较多。（5）与OGD/R相比,α-细辛醚中MDA和ROS显著降低,SOD活性升高。（6）Hoechst荧光结果和AV/PI流式结果显示,α-细辛醚减轻OGD/R诱导的细胞凋亡。（7）分子对接表明α-细辛醚可以与PI3K结合,DARTS和CETSA的实验结果表明,α-细辛醚可以直接与PI3K结合,PI3K可能是α-细辛醚的靶点。结论通过网络药理学可视化成分和疾病靶点、通路的关系。HXF对IS具有治疗作用,这与PI3K/AKT通路的激活有关,α-细辛醚是HXF的潜在活性成分之一。