脂质体可以提高药物的稳定性,降低毒副作用,并可以通过增强渗透与滞留(Enhanced Permeation and Retention,EPR)效应使装载抗肿瘤药物的脂质体在肿瘤组织富集以提高药物在肿瘤组织的被动靶向性。当脂质体进入肿瘤组织后将包裹的药物释放到肿瘤间质,以游离药的形式进入到肿瘤区细胞中,这一过程相对比较缓慢,并且不能有效的进入到多药耐药的肿瘤细胞内。构建叶酸(Folic Acid,FA)修饰的聚乙二醇(PEG)化磷脂主动靶向脂质体,可以改变脂质体的向肿瘤细胞递送药物的方式。由于,肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体,进入肿瘤区的表面修饰叶酸的脂质体可以与其特异性结合,将完整的脂质体内吞进入肿瘤细胞,之后,富集到细胞内的脂质体再释放出游离药杀伤肿瘤细胞。目的:本研究制备叶酸靶向脂质体,通过改变药物的递送途径,增加药物在肿瘤细胞内的富集并实现有效释放,从而提高药物的治疗指数。同时,进行克服肿瘤细胞多药耐药性的研究,为肿瘤多药耐药治疗提供依据。方法:采用Western Blot检测细胞内叶酸受体蛋白的表达,采用实时荧光定量PCR的方法检测叶酸受体基因mRNA的表达,从而筛选出高表达叶酸受体的肿瘤细胞用于后续试验。确定叶酸靶向脂质体的制备方法:首先制备以硫酸铵溶液为内相的空白脂质体,通过葡聚糖凝胶Sephadex G-75柱透析置换空白脂质体外相,形成硫酸铵梯度,将药物与透析后的空白脂质体孵育一定时间即得脂质体混悬液。进行叶酸靶向脂质体的细胞摄取试验,以阿霉素为药物,设计三因素三水平试验,考察不同DSPE-mPEG2000含量、叶酸辅料类型、叶酸辅料含量、脂质体粒度等因素对肿瘤细胞摄取率的影响,从而筛选出优化的处方。以优化的处方制备米托蒽醌叶酸靶向脂质体,进行制剂学性质研究,主要包括外观、pH值、粒度、渗透压、包封率、含量和释放率等指标的测定,并进行2个月的稳定性试验。采用MCF-7人乳腺癌细胞和MCF-7/ADR耐药细胞对米托蒽醌游离药、米托蒽醌无叶酸脂质体(MIT-L)、米托蒽醌叶酸靶向脂质体(MIT-FL)进行细胞摄取试验及细胞抑制(MTT)试验,考察叶酸靶向脂质体克服多药耐药性情况。进行高表达和低表达叶酸α受体的肿瘤细胞和表达叶酸β受体的肿瘤细胞的细胞摄取实验及细胞抑制实验,以考察叶酸靶向脂质体在叶酸表达程度不同的细胞中的富集量差异,以及进入细胞的脂质体能否有效的起到杀伤肿瘤细胞的作用。以NOD-SCID雌性小鼠为实验动物,建立人KB 口腔表皮样癌移植瘤肿瘤模型,进行米托蒽醌叶酸靶向脂质体的药效学研究,考察小鼠的存活、体重变化和肿瘤变化情况,以肿瘤体积抑制率来评价药物治疗效果,以小鼠体重的降低来评价药物的毒性。结果:从蛋白水平和mRNA水平分别筛选出了高表达和低表达叶酸α受体的肿瘤细胞,表达量顺序如下:KB>BEL-7402>SPC-A-1>SMMC-7721>MCF-7,和表达叶酸 β 受体的肿瘤细胞人髓性白血病MV4-11和小鼠淋巴瘤白血病L1210,且蛋白质和mRNA水平的检测结果基本一致。硫酸铵梯度法制备的叶酸靶向脂质体包封率高达99%以上,重现性良好。优化的处方为A以占HSPC的摩尔比计,DSPE-mPEG2000为2.6%、DSPE-PEG3350-FA为0.4%、粒度为90 nm;B DSPE-mPEG200 为 2.6%、CHOL-PEG3350-FA 为 0.4%、粒度为 70nm，质量研究结果显示:两个处方六批米托蒽醌叶酸靶向脂质体的pH值、渗透压、粒径、包封率均符合要求,8小时体外释放率分别为0.69%、9.30%。稳定性结果显示:脂质体混悬液在2-8℃条件下存放2个月,上述各指标均无明显变化。对比米托蒽醌游离药和MIT-L进入MCF-7细胞和MCF-7/ADR耐药细胞的药物摄取发现,MCF-7细胞摄取量明显多于MCF-7/ADR细胞,表明MCF-7/ADR细胞对游离米托蒽醌产生耐药性;而对于MIT-FL,MCF-7细胞摄取量少于MCF-7/ADR细胞,连有叶酸的脂质体与叶酸受体结合内吞进入细胞,药物进入细胞的多少与细胞表面叶酸受体的表达有关,MTT实验结果显示,药物以脂质体形式进入细胞后,MIT-FL和MIT-L均可抑制MCF-7和MCF-7/ADR细胞的生长,对于MCF-7细胞,相同浓度下MIT-FL与MIT-L抑制率的差异不大,而在耐药细胞MCF-7/ADR中,相同浓度下MIT-FL的抑制率明显高于MIT-L。表明以叶酸为靶向机制通过内吞进入细胞的脂质体可以克服肿瘤细胞的多药耐药性。细胞摄取实验结果表明,对于叶酸受体高表达的细胞,叶酸靶向脂质体相对于无叶酸脂质体,摄取率高,靶向性强,对于叶酸受体相对低表达的细胞,两脂质体靶向性差异不明显。此外,靶向脂质体进入叶酸受体相对高表达的细胞的摄取率明显高于叶酸受体相对低表达的细胞,表明当脂质体表面修饰了叶酸配体后,可提高靶向到叶酸受体高表达肿瘤细胞的能力。MTT实验显示,大单室两个脂质体处方对细胞均无抑制作用,米托蒽醌叶酸靶向小单室脂质体(MIT-FSL)对细胞有显著的抑制作用,经计算其IC50值为3644.3 ng/mL,米托蒽醌无叶酸小单室脂质体(MIT-SL)也有抑制作用,其IC50值为32583.8 ng/mL。故MIT-FSL抑制作用大于MIT-SL,小单室脂质体修饰叶酸后能够增加向高表达叶酸受体细胞内的递送,且能够在细胞内有效释放,达到杀伤细胞的作用。小鼠接种人KB 口腔表皮样癌移植瘤毒性结果显示,游离药物组的动物体重下降较脂质体组大,即脂质体的毒性低于游离药物,说明将米托蒽醌包裹于脂质体中可降低药物的毒副作用。药效结果表明,各给药组对肿瘤的生长均有抑制作用,但脂质体组对肿瘤的抑制作用弱于游离药组,推其原因为脂质体相较于游离药在肿瘤部位的灌注不良,即一定时间内进入肿瘤区的药物浓度低于游离药。另外,脂质体的释放率可能也是导致药效不能发挥的原因。结论:将叶酸修饰于脂质体表面,制备得到的叶酸靶向脂质体,包封率高,重现性好。其具有两大优势,一为可有效增加进入肿瘤耐药细胞的药物含量,克服多药耐药。二为可有效靶向到高表达叶酸受体的肿瘤细胞,增加药物在细胞内的富集量并实现胞内有效释放,提高疗效。