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为了研究猪瘟病毒对猪血管内皮细胞的特异亲嗜性造成血管破裂、出血的发病机理,我们分别用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化猪血管内皮细胞,成功地分离培养了猪血管内皮细胞。通过原代培养、传代培养、纯化及生长曲线等的研究,了解了猪血管内皮细胞在体外培养过程中的生长特性;并通过剂量-反应关系研究了胰岛素对血管内皮细胞生长增殖的促进作用。结果表明:1.用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离均可获得接种量的原代培养物,但用Ⅰ型胶原酶消化能较好的分离猪血管内皮细胞,对细胞的损伤小,获得的细胞培养时贴壁率高。接种后培养24小时,细胞呈萌芽形式生长,形成许多小岛状的细胞集落,48小时细胞集落增大,可区分出细胞密集的中央区及细胞密度较小的周边区。原代细胞6~7天可汇合形成单层。2.对于30~40日龄仔猪的血管段用0.1%Ⅰ型胶原酶消化10分钟,获得的内皮细胞最多,超过10分钟,混入的成纤维细胞明显增加。3.与0.25%的胰蛋白酶相比,用ATV使用液结合吸管吹打更适合于猪血管内皮细胞消化传代。4.根据成纤维细胞较内皮细胞对柠檬酸胰蛋白酶更敏感,可用0.25%柠檬酸胰蛋白酶清除内皮细胞中有时混杂的成纤维细胞,混合物用柠檬酸胰蛋白酶消化,并在倒置显微镜下观察,当有20%~40%细胞脱落时立即终止消化,收集的细胞主要为成纤维细胞,未脱壁的细胞主要为内皮细胞,继续培养后重复此过程1~2次可获得纯度很高的内皮细胞。5.培养细胞在相差显微镜下观察,呈典型的“铺路石”状排列,细胞间存在接触抑制;在扫描电镜下观察,细胞多角形或形状不规则,胞浆中伸出许多细长突起,细胞表面有许多圆形小凹窝;第Ⅷ因子相关抗原抗体间接免疫荧光染色,可检测到细胞核周围的胞质呈明显的黄绿色荧光。以上几点可证明培养的细胞为内皮细胞。 6.与MEM相比,M-199更适合于用作培养猪血管内皮细胞的基础培养基。7.生长液中加入胰岛素和氢化可的松,可明显促进细胞的生长和增殖,剂量-反应曲 猪血管内皮细胞体外培养方法的建立及生长特性研究 线表明胰岛素的最适用量为8卜g/InL。8.从生长曲线可以看出,传代猪血管内皮细胞接种后有1天左右的滞留期,然后细 胞进入对数生长期,可持续2~3天,第5天进入平台期,第8天细胞开始脱落死 亡。