背景组织缺氧是细胞内氧含量低于正常水平的状态,常引起代谢产物、蛋白质和酶的变化,造成细胞的功能障碍。失血是导致组织缺氧的重要原因之一。由于红细胞数量减少,血红蛋白含量下降,导致运输到局部组织的氧气减少,发生组织缺氧。因此,缺氧性组织损伤是缺血性疾病中常见的并发症,对心脏、脑、肺等多种人体器官造成严重损害。缺氧性组织损伤的早期诊断和干预对提高缺血性疾病患者的预后具有重要的现实意义。目前,临床实践中,常用血红蛋白（Hb）、动脉血氧分压（PaO2）和氧饱和度（SaO2）评估全身循环的氧含量和失血情况,以作为患者是否需要输注红细胞的依据。然而,这些评价指标仅能评估循环氧含量,对于组织层面含氧水平的监测是不敏感和非特异的。而组织和细胞层面氧含量的监测主要依赖于微粒探针、极性光谱微导管、氧电极等生物传感器的植入。由于这些植入技术的有创性,导致其在临床实践中难以广泛普及和应用。因此,寻找易于获取和检测的组织缺氧生物标志物,即可有效解决组织氧含量的监测技术难题,辅助组织缺氧的临床诊断,有效指导缺血性疾病患者的早期输血治疗。近年来,基因组学、代谢组学、蛋白质组学等多组学技术广泛应用于开发生物标志物和治疗靶点的研究中,成为分子和细胞生物学研究不可或缺的辅助工具。因此,本研究拟联合代谢组学和蛋白组学技术,结合生物信息学分析方法和平行反应监测技术的验证手段,筛选组织缺氧的血浆生物标志物,探究缺氧调控机制和代谢图谱的变化。目的1.早期筛选和辅助诊断:构建失血性组织缺氧的大鼠模型,开发组织缺氧的血浆生物标志物,为其早期筛选和辅助诊断提供理论基础。2.探究缺氧适应性调控机制,促进个性化治疗:探究组织缺氧对内皮细胞功能特性的影响和机体代谢图谱的变化,有助于缺血性疾病的氧供、氧控和输血治疗策略的定制化管理。方法1.构建失血性组织缺氧的大鼠模型,验证模型有效性依据完全随机原则,选取18只10周龄的SPF级雄性F344近交系大鼠,分为3组:正常对照组、缺氧7天组和缺氧15天组。自实验第一天起,缺氧组大鼠每间隔1日,从眼底静脉丛采血,单次采血量占全身循环血容量的20%。利用五分类计数仪检测红细胞、血红蛋白和血小板的变化;利用动脉血气分析仪检测动脉血氧分压,评估缺氧情况。2.联合代谢组学和蛋白组学技术初筛差异性表达蛋白利用LC-MS/MS液相色谱—质谱联用、HPLC高效液相色谱和飞行时间质谱系统（GC-TOF/MS）技术,检测正常组大鼠和缺氧7天大鼠血浆中蛋白质和小分子代谢物的变化。利用生物信息学分析,包括GO富集和KEGG通路富集,预测组织缺氧相关的候选生物标志物和缺血缺氧相关信号通路;3.双重验证血浆、心脏、脑、和肺组织中生物标志蛋白的表达通过合成初筛蛋白的特异性目标肽段,定量检测血浆、心脏、脑、和肺组织中22个缺氧候选蛋白的表达情况,利用免疫印迹方法进一步验证该结果的可比性、可靠性,并分析这些候选生物标志物与缺氧的相关性和组织特异性。4.探讨缺氧对内皮细胞功能特性的影响及其适应性调控机制在排除缺血因素的前提下,构建心动脉血管内皮细胞（TeloHAEC）的体外缺氧模型。在3%氧浓度的条件下培养72小时,分别于0、6、12、24、48和72h的时间点,检测蛋白表达、新生血管生成和TeloHAEC细胞功能变化。利用免疫印迹法,从细胞层面再次验证心脏缺氧相关候选生物标志蛋白的表达;利用酶联免疫法（ELISA）检测缺氧诱导因子HIF的DNA结合活性、血管内皮生长因子（VEGF）含量的动态变化;采用MTT 比色法检测细胞活性和增殖;采用流式细胞术检测细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡等功能变化。结果1.建立缺血性组织缺氧大鼠模型本研究中,大鼠分别于1、3、5、7、11、13和15天,共采血7次。与第1天相比,第15天的红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）和动脉血氧分压（PaO2）水平均显著下降（P＜0.001）,而血小板计数（PLT）呈小幅度增加趋势,差异有统计学意义（Day 1 vs Day 15:408.4±172.8 vs 922.0±25 3.6 1 09/L,P＜0.05）。此外,PaO2由 117.0±5.3 mmHg,下降为82.8±7.2 mmHg,表明发生了缺氧。这些结果表明,失血性缺氧大鼠模型成功建立。2.质谱初筛得到22个组织缺氧候选蛋白和6个显著富集的信号通路初筛22个候选蛋白分别是:血管细胞黏附分子1（Vcam1）、玻连蛋白（Vtn）、维生素K依赖性血浆糖蛋白Z（Proz）、花生四酸酯15脂加氧酶（Alox15）、血小板反应蛋白（Thbs4）、胞质氨基肽酶（Lap3）、骨桥蛋白（OPN）、维生素K依赖性血浆糖蛋白S（Pros1）、内皮唾酸蛋白（endosialin）、血清对氧磷酶（Pon1）、半乳糖凝集素3（Gal-3）、转铁蛋白受体蛋白（Tfrc）、基质金属蛋白酶2（Mmp2）、酪氨酸3单加氧酶（Ywhaz）、酪氨酸3单加氧酶（Ywhae）、细胞黏合素C（Tnc）、Ⅰ型胶原α2（Col1α2）、热休克蛋白（Hsp90b1）、热休克蛋白（Hspa4）、蛋白激酶C（Prkcsh）、凝集素结构域家族（Clec3b）、丝素a相互作用蛋白（Filip11）。差异表达蛋白主要富集于以下6个信号通路:rno04610凝血和补体级联途径、rno04610 PI3K-Akt 信号通路、rno04912 GnRH 信号通路、rno04926 Relaxin 信号通路、rno04141内质网蛋白加工和rno04933 AGE-RAGE信号通路。其中有9个差异表达蛋白共同参与PI3K-Akt信号通路。补体、凝血级联途径和PI3K-Akt信号通路可能是失血性缺氧反应的主要响应途径,与下游细胞增殖、血管生成和迁移等靶基因的高表达相关。3.组织缺氧候选生物标志物的组织相关性验证结合靶向蛋白组学和免疫印迹方法,双重复筛了候选生物标志蛋白的表达,可见血浆中的差异表达蛋白在心、肺和脑组织中显现出不同的变化趋势。血红蛋白稳定蛋白（Ahsp）、对氧磷酶（Pon1）和半乳糖凝集素3结合蛋白（Gal-3）在血浆和心脏中显著升高,可能在心脏缺氧方面具有提示作用;骨桥蛋白（OPN）在血浆和脑组织中显著升高,可能在脑缺氧方面具有提示作用;内皮素（Endosialin）和Gal-3在血浆和肺组织中表达升高,可能在肺缺氧方面具有提示作用;花生四烯酸-15-脂加氧酶（Alox15）、转铁蛋白受体（Tfrc）和蛋白激酶C（Prkcsh）在血浆、心、脑、肺中均显著升高,丝素a相互作用蛋白（Filip11）和Ⅰ型胶原α 2（Col1a2）在心、肺、脑中的表达量存在不同程度的降低,可能作为循环缺氧的潜在生物标志物。4.探究缺氧对内皮细胞功能特性的影响及其适应性调控机制4.1缺氧激活HIF的转录活性,促进Endosialin、VEGF和Gal-3的表达,刺激新生血管生成建立3%氧浓度的TeloHAEC细胞体外缺氧模型。缺氧6小时后,细胞内HIF-1α的DNA结合活性显著增强。下游蛋白Endosialin、VEGF和Gal-3随缺氧时间延长呈上升趋势,表明内皮细胞增殖和新生血管形成。4.2缺氧调控铁代谢大鼠建模15天内,血浆转铁蛋白呈持续上升趋势（Day 1 vs Day 11:303.6±98.6 vs 442.6±71.2 mg/dL,P＜0.05）,血清铁含量在一周内呈下降趋势（Day 1 vs Day 7:29.0±5.3 vs 18.6±5.1 μmol/L,P＜0.05）,后逐渐上升（Day 7 vs Day 15:18.6±5.1 vs 40.4±7.4 μmol/L,P＜0.001）。该结果显示,在缺血缺氧初期,铁蛋白水平急剧消耗;延长缺氧时间,机体能够调节铁代谢以适应生理需求。转铁蛋白和血清铁水平的监测对机体缺血、缺氧的诊断可能存在提示意义。4.3缺氧影响细胞活性和增殖TeloHAEC细胞在缺氧24小时内,细胞活性降低（常氧组vs缺氧24h组:0.33±0.06%vs 0.28±0.04%,P＜0.05）,增殖速率减慢;培养48小时后,缺氧组细胞活性升高（常氧组 vs 缺氧 48h 组:0.48±0.08%vs 0.58±0.11%,P＜0.05）,增殖速率显著升高。这表明短期缺氧可降低细胞活性和增殖速率,长期慢性缺氧可促进细胞增殖。4.4短期缺氧导致细胞G1/S周期阻滞缺氧12小时,S期TeloHAEC细胞数量显著减少,G0/G1期细胞百分比增高,表现为G1期阻滞。缺氧12小时与缺氧72小时组相比,S期细胞分布比例分别为9.1±3.4%和 14.3 ± 4.2%,G0/G1 期细胞分布比例分别为 75.0±3.7%和 66.7±9.6%,表明缺氧72小时G1/S周期阻滞情况有好转迹象。这些数据表明,细胞对缺氧的适应与周期动力学的调整相关,短期缺氧可诱导G1/S周期阻滞,且这种周期停滞的现象是短暂和可逆的。4.5缺氧诱发细胞凋亡损伤TeloHAEC细胞在缺氧状态下培养6、12、24、48和72小时,各时间点的细胞早期凋亡数量均增加。缺氧72小时,晚期凋亡和坏死细胞的数量也显著升高,差异有统计学意义。结论1.本研究初筛22个组织缺氧候选蛋白和6个信号通路。补体、凝血级联途径和PI3K-Akt信号通路可能是失血性缺氧反应的主要响应途径,与下游细胞增殖、血管生成和迁移等靶基因的高表达相关。2.缺氧相关血浆标志蛋白在心、肺、和脑的表达具有一定组织特异性。Ahsp、Pon1、Gal-3可能在心脏缺氧方面具有提示作用;OPN可能在脑组织缺氧方面具有提示作用;Endosialin、Gal-3可能在肺组织缺氧方面具有提示作用;Alox15、Tfrc、Filip11、Col1a2、Prkcsh可能作为循环缺氧的潜在生物标志物组。3.缺氧影响内皮细胞功能,促进调控机体适应性反应。缺氧激活HIF-1α转录,促进新生血管生成;缺氧可调节转铁蛋白和铁蛋白的表达,使铁代谢的模式发生适应性改变;缺氧对细胞的功能影响是时间依赖性的。细胞对缺氧的适应与周期动力学的调整相关,短期缺氧降低TeloHAEC细胞增殖活性,诱导G1/S细胞周期阻滞。长期缺氧可在一定程度上促进细胞增殖,逆转G1/S周期停滞现象。这种适应性调控机制可能依赖于HIF-1α的积累或降解。4.组学策略可能是一种探索缺氧生物标志物和机制的强有力的方法,它可能成为一种新的工具,以助于将生物医学研究结果应用于临床实践和治疗管理中。