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第一部分:SNHG6对肝癌基因组甲基化水平及甲基化谱的影响目的:本部分需要明确长链非编码RNA（lnc RNA）-SNHG6对肝癌（HCC）组织及细胞基因组甲基化水平的影响,并细化SNHG6水平的变化所引起的肝癌细胞基因组甲基化谱的改变。此外,我们还需要初步探明引起这种整体甲基化改变的原因。方法:在肝癌、癌旁组织以及肝癌细胞系中,我们利用逆转录-荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、酶联免疫吸附（ELISA）以及超高效液相色谱（UPLC）的方法分别检测了SNHG6、5甲基胞嘧啶（5mC）以及S-腺苷蛋氨酸（SAMe）在肝癌、癌旁组织及肝癌细胞系中的表达水平。根据三者表达量,利用二元相关性回归分析三者之间的关联。再选取肝癌细胞系,过表达或干扰SNHG6,同样用ELISA测定细胞内5mC含量;再利用UPLC测定细胞内SAMe及S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的浓度变化情况,随后利用Illumina Methylation 850K测序技术观察肝癌基因组甲基化谱的改变。结果:SNHG6在肝癌组织中表达升高,而5mC以及SAMe在肝癌组织中呈现低水平。在肝癌、癌旁以及肝癌细胞系中,我们发现SNHG6与5mC及SAMe均呈负相关,而5mC与SAMe呈正相关。随后,在肝癌细胞系中,我们发现SNHG6可以负向调控5mC水平和SAMe浓度,以及SAMe/SAH比值。甲基化测序结果显示,SNHG6的改变能通过对肝癌基因组多个位点带来甲基化修饰改变从而改变基因组甲基化谱。另外,经过多重假设检验,我们发现多个HCC相关基因的启动子区甲基化程度受到SNHG6调控。结论:长链非编码RNA-SNHG6可以通过下调肝癌细胞内SAMe浓度从而下调肝癌基因组甲基化水平并改变其甲基化谱。第二部分:SNHG6下调细胞内S-腺苷蛋氨酸浓度的分子机制目的:这一部分我们将利用一系列体外实验明确SNHG6是通过何种分子机制来在肝癌细胞内下调SAMe浓度水平。方法:我们在肝癌细胞系中干扰或过表达SNHG6,利用qPCR及western blot实验检测调控SAMe的关键酶,即甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）的表达水平。随后我们利用生物信息学预测发现miR-1297和肉瘤融合蛋白（FUS）可能是中间调控分子。因此我们利用荧光原位杂交（FISH）观察SNHG6及miR-1297的亚细胞分布,同时利用RNA-RNA共沉淀分析（MS2-RIP）验证miR-1297与SNHG6的直接结合;补救实验平行验证SNHG6对miR-1297的吸附作用。下游再利用双荧光素酶报告基因系统及RNA降解实验探究miR-1297对MAT2A mRNA及FUS mRNA的下调作用。最后,我们利用免疫组织及细胞化学染色（IHC/ICC）明确FUS的亚细胞定位;RNA免疫沉淀分析（RIP）验证FUS与MAT1A mRNA的直接结合作用;在肝癌细胞内过表达或干扰FUS,qPCR及Western blot检测MAT1A mRNA及蛋白改变;FISH可视化观察FUS过表达对MAT1A mRNA亚细胞分布的影响。结果:上述qPCR及Western blot结果显示,SNHG6可以上调MAT2A mRNA及蛋白水平;同时SNHG6还可以下调MAT1A蛋白表达,但对其mRNA的水平无明显影响。就SNHG6对MAT2A的调控而言,荧光素酶报告基因及RNA降解实验发现miR-1297能够结合MAT2A的3’端非翻译区（UTR）并抑制其mRNA水平;而MS2-RIP及补救实验发现SNHG6能通过吸附miR-1297解除后者对MAT2A 3’UTR的抑制从而上调MAT2A表达。而就SNHG6对MAT1A的调控而言,其可以通过同样的机制吸附miR-1297上调核蛋白FUS的表达;而RIP结果证明FUS可以直接结合MAT1A mRNA;FISH可视化结果发现,FUS过表达后,部分MAT1A mRNA卡在细胞核中,即SNHG6通过FUS介导的核质穿梭调控MAT1A的蛋白表达。结论:SNHG6通过miR-1297介导的两条通路同时上调MAT2A及下调MAT1A的表达,从而下调细胞内SAMe浓度。第三部分:SNHG6通过吸附miR-1297激活两条SAMe依赖型正反馈通路目的:第三部分我们首先需要明确上述的2条调控通路是否均发挥重要作用,并且其中的关键分子FUS及MAT2A是否存在SAMe依赖型表达,同时验证SNHG6激活的调控通路具有正反馈效应来维持SAMe的低水平浓度,进而造成基因组的低甲基化。方法:我们在肝癌细胞内过表达MAT1A并干扰MAT2A,用ELISA的方法检测细胞内5mC含量的变化。随后,我们用SAMe或SAH处理肝癌细胞,利用qPCR及Western blot实验检测SNHG6、miR-1297、FUS、MAT1A、MAT2A的表达。最后,我们利用甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）的方法检测了SAMe/SAH浓度的改变对MAT2A及FUS启动子甲基化程度的影响。结果:在肝癌细胞中过表达MAT1A或干扰MAT2A,均会使得细胞内5mC含量升高,且这两者具有协同效应。SAMe或SAH处理后,我们发现MAT2A及FUS的mRNA水平受到SAMe/SAH比值的调控,而在此浓度下,其余基因表达并不受影响。最后,MeDIP结果显示,SAMe可以上调MAT2A及FUS启动子甲基化水平,即MAT2A和FUS是SAMe依赖型表达,当细胞内SAMe水平下降后,前两者表达进一步升高,从而形成2条正反馈环路。结论:上述调控SAMe浓度的2条通路的关键分子MAT2A和FUS同样受到SAMe的调控,因此SNHG6通过吸附miR-1297激活了2条正反馈通路来维持肝癌基因组的低甲基化水平。