海水鱼类“白点病”是由刺激隐核虫感染引起的一种寄生虫性疾病,该病至今仍缺乏安全高效的商品化防治药物,对海水鱼类养殖造成巨大的经济损失,迫切需要寻找安全高效的防治方法。天然化合物作为候选渔药具有生物相容性好、残留低和环境友好等优势。为此,本文以刺激隐核虫幼虫为研究对象,从36种天然化合物中筛选出具有良好抗刺激隐核虫效果的天然化合物,并检测其中效果最显著的天然化合物对卵形鲳鲹“白点病”的防治效果;评价其对卵形鲳鲹的安全性;研究其对卵形鲳鲹生长和非特异免疫功能的影响;确定其在卵形鲳鲹体内的药代动力学特征,主要结果如下:1.抗刺激隐核虫天然化合物筛选研究:根据文献报道,选取36种具有抗菌或抗寄生虫活性的中草药活性成分作为供筛的天然化合物,以1 μg/mL的终浓度加入含有刺激隐核虫幼虫的海水中,30 min后用显微镜直接观察幼虫的形态变化及纤毛运动情况,检测其对刺激隐核虫幼虫的抑杀效果。结果表明,36种供筛天然化合物中,对刺激隐核虫幼虫具有显著杀灭效果的有和厚朴酚、厚朴酚、齐墩果酸、苦参碱和柠檬苦素,它们对刺激隐核虫幼虫的杀灭率依次分别为1 00%、67.47%、61.07%、14.00%和7.67%;其中,和厚朴酚对刺激隐核虫幼虫离体杀灭效果最佳。2.和厚朴酚对刺激隐核虫非寄生期虫体的抑杀效果研究:以终浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μg/mL的和厚朴酚加入含有刺激隐核虫幼虫的海水中,30 min后以显微镜直接观察幼虫的形态变化及纤毛运动情况,评价和厚朴酚对幼虫的杀灭效果。结果表明,和厚朴酚30 min杀灭刺激隐核虫幼虫的半数有效剂量(EC50)为0.79 μg/mL(R2=0.996)。以终浓度为0.1、0.5、1.0、2.0和4.0μg/mL的和厚朴酚加入含有刺激隐核虫包囊前体的海水中,作用8 h,然后以不含和厚朴酚的海水连续培养该包囊前体6 d,以显微镜直接观察由包囊前体转化成包囊后的孵化率,检测和厚朴酚对包囊前体的抑杀效果。结果显示,和厚朴酚8 h内抑制刺激隐核虫包囊前体转化率的半数有效浓度(EC50)为 1.59μg/mL(R2=0.995)。以终浓度为 0.05、0.10、0.25、0.50 和1.0 μg/mL的和厚朴酚加入含有刺激隐核虫包囊的海水中,作用8h,然后以不含和厚朴酚的海水连续培养该包囊4 d,以显微镜直接观察包囊的孵化率,检测和厚朴酚对包囊的杀灭效果。结果表明,和厚朴酚8 h内抑制刺激隐核虫包囊孵化率的半数有效浓度(EC50)为 0.59 μg/mL(R2=0.990)。3.和厚朴酚对卵形鲳鲹“白点病”的防治效果研究:分别投喂卵形鲳鲹含100、200和400 mg/kg和厚朴酚的饲料,7 d后感染刺激隐核虫幼虫,然后继续投喂含和厚朴酚饲料,通过计数卵形鲳鲹右二鳃刺激隐核虫滋养体数量来检测和厚朴酚对寄生期滋养体的杀灭效果。结果显示,刺激隐核虫幼虫感染后第8 d,投喂含100、200和400 mg/kg和厚朴酚饲料的卵形鲳鲹右二鳃上的滋养体数量可有效地降低84.11%、98.96%和99.31%。卵形鲳鲹感染刺激隐核虫幼虫后,连续投喂含400 mg/kg和厚朴酚的饲料14 d,考察和厚朴酚对患“白点病”卵形鲳鲹成活率的影响。结果显示,投喂含400 mg/kg和厚朴酚饲料的卵形鲳鲹相对保护率为65%。通过趋化模型,检测刺激隐核虫幼虫对0.5 μg/mL和厚朴酚、厚朴酚、齐墩果酸、苦参碱、柠檬苦素和孔雀石绿溶液趋化率的影响。结果显示,刺激隐核虫幼虫对0.5 μg/mL和厚朴酚、厚朴酚和苦参碱溶液的趋化率显著低于对空白对照组的趋化率;刺激隐核虫幼虫对海水以及0.5 μg/mL孔雀石绿、齐墩果酸和柠檬苦素溶液的趋化率与对空白对照组的趋化率无显著差别。以含100、200和400 mg/kg和厚朴酚的饲料连续投喂卵形鲳鲹,并在第7 d取样血清和肌肉,然后利用趋化模型检测刺激隐核虫幼虫对该血清和肌肉趋化率的影响。结果显示,刺激隐核虫幼虫对200 mg/kg组卵形鲳鲹血清的趋化率显著低于对空白对照组血清的趋化率;刺激隐核虫幼虫对100、200和400 mg/kg组卵形鲳鲹肌肉的趋化率极显著低于对空白对照组肌肉的趋化率。4.和厚朴酚对卵形鲳鲹的安全性评价实验:以10、50、300、1000和2000 mg/kg剂量(和厚朴酚:鱼体重)灌胃卵形鲳鲹,观察14d。结果显示,卵形鲳鲹灌胃服用和厚朴酚,剂量在300 mg/kg以下无中毒症状;剂量在1000 mg/kg和2000 mg/kg的死亡率分别为16.67%和33.34%,其口服急性毒性呈剂量依赖性。将终浓度为0.0、12.5、25.0、50.0、125.0、250.0和500.0 μg/mL和厚朴酚与家兔、卵形鲳鲹血红细胞37℃共孵育60 min,检测和厚朴酚对家兔和卵形鲳鲹的溶血作用。结果表明,导致1%和50%家兔血红细胞溶解的和厚朴酚浓度(EC1和EC50)分别是59.74和105.87μg/mL;导致1%和50%卵形鲳鲹血红细胞溶解的和厚朴酚浓度(EC1和EC50)分别是6.36和46.69 μg/mL,为和厚朴酚100%抑杀刺激隐核虫幼虫浓度的6.36和46.69倍。5.和厚朴酚对卵形鲳鲹生长和非特异免疫功能的影响研究:以含200 mg/kg和厚朴酚的饲料连续投喂卵形鲳鲹2个月,实验组和对照组的增重率分别为(332.99±56.96)%和(288.48±23.32)%,无显著差异。以含200 mg/kg和厚朴酚的饲料连续投喂卵形鲳鲹5个月,实验组的增重率(3046.88±545.99)%显著高于对照组的增重率(1942.26±466.22)%。以含200 mg/kg和厚朴酚的饲料投喂卵形鲳鲹4h后,实验组卵形鲳鲹血清的酸性磷酸酶活性极显著低于对照组;实验组与对照组卵形鲳鲹血清的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶活性和巨噬细胞的呼吸爆发活性没有显著性差异。以含200 mg/kg和厚朴酚的饲料连续投喂卵形鲳鲹15 d(每天2次),实验组卵形鲳鲹血清的过氧化氢酶活性显著高于对照组;而溶菌酶、酸性磷酸酶和巨噬细胞的呼吸爆发活性与对照组无显著差异。以含200 mg/kg和厚朴酚的饲料连续投喂卵形鲳鲹90 d(每天2次),实验组卵形鲳鲹血清的酸性磷酸酶活性和巨噬细胞的呼吸爆发活性显著高于对照组;而实验组与对照组卵形鲳鲹血清的溶菌酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性无显著差别。6.和厚朴酚在卵形鲳鲹体内的药代动力学研究:以12 mg/kg(和厚朴酚:鱼体重)剂量灌胃卵形鲳鲹,灌胃后0.5、1、2、3、4、8、12和24 h取样肝、肾、鳃、表皮、肌肉和血浆,利用高效液相色谱检测卵形鲳鲹血浆与各组织的和厚朴酚含量,使用非房室模型的统计矩方法进行数据分析。结果显示,和厚朴酚在肝、肾、鳃、表皮、肌肉和血浆的药时曲线下面积(AUC0-∞)分别为182.93、283.95、200.46、89.88、9.70 μg·h/g 和 41.65 μg·h/mL;其半数药量消除时间(t1/2)分别为 5.63、1.19、1.26、1.32、1.32 和 0.93 h;其峰值浓度(Cmax)分别为 134.84、136.97、239.69、46.39、3.96μg/g 和 38.92 μg/mL,其达峰时间(Tmax)分别为 0.5、0.5、0.5、3、1 和 0.5 h;其平均驻留时间(MRT0-∞)分别为1.87、4.03、2.20、4.05、2.24和2.91 h。其表观分布容积(Vd)为0.39 L/kg。卵形鲳鲹灌服和厚朴酚后,和厚朴酚在0.5 h内被快速吸收入血,然后快速分布至肝、肾、鳃、肌肉和表皮;24 h内和厚朴酚在各组织的分布量由高至低分别是肾、鳃、肝、表皮和肌肉。卵形鲳鲹单次灌服12 mg/kg和厚朴酚后,其肝、肾、鳃、表皮、肌肉和血浆中的和厚朴酚24 h内完全消除。本文研究结果表明,和厚朴酚不仅有高效的抗刺激隐核虫幼虫效果,对卵形鲳鲹“白点病”也有良好的防治作用;并且,有效剂量的和厚朴酚在卵形鲳鲹体内具有安全、低残留的特点,还能一定程度促进卵形鲳鲹生长和提高其非特异免疫功能;在海水鱼类“白点病”安全高效防治药物开发上具有良好的前景。