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第一部分肺炎衣原体感染对THP-1源性巨噬细胞泡沫化的影响目的：本部分实验构建了肺炎衣原体(C.pn)感染人白血病单核细胞(THP-1)源性的巨噬细胞的细胞感染模型,从而研究C.pn感染对THP-1源性巨噬细胞转化成为泡沫细胞的作用。方法：体外培养THP-1细胞,采用160nmol/L佛波酯处理48h分化为巨噬细胞后,将细胞随机分为3组：(1)对照组；(2)不同浓度C.pn感染组：分别给予细胞1×105IFU、4×105IFLU、5×105IFU或者1×106IFUC.pn;(3) C.pn感染不同时间组：C.pn感染细胞24h.48h、72h。C.pn是采用水平离心法在体外人喉上皮癌(Hep-2)细胞中培养增殖收获。以上每组细胞均使用含有50μg/ml低密度脂蛋白(LDL)的培养基进行培养,光镜下观察C.pn是否成功感染Hep-2。油红O染色后研究脂滴数目和体积的变化,并进行泡沫细胞计数。结果：光镜下可见PMA成功将THP-1细胞诱导为贴壁的巨噬细胞,C.pn成功感染Hep-2和THP-1源性巨噬细胞。与对照组比较,细胞内脂滴数目随C.pn感染浓度的增加而增加,随着感染时间增长而增加,脂滴体积也有所增大,泡沫细胞数逐渐增加(p<0.05)。在高浓度(5x105、1×106IFU)和长时间(48、72h)的C.pn感染组中,细胞内脂滴显著增加(p<0.05)。结论：在负荷LDL的条件下,高浓度(5×105、1×106IFU)的C.pn感染48h和72h后,诱导THP-1源性巨噬细胞形成泡沫细胞。第二部分PPARα/γ信号通路在肺炎衣原体诱导泡沫细胞形成中对胆固醇代谢关键基因的调控作用目的：以THP-1源性巨噬细胞为研究细胞模型,研究PPARα/γ信号通路对胆固醇代谢关键基因CD36、SR-A1、ACAT1、ABCA1、ABCG1的调控作用,进而影响C.pn导致的THP-1巨噬细胞泡沫化过程。方法：将针对PPARα或PPARγ基因合成PPARα/γ siRNA-1,2及阴性对照序列分别转染入细胞。荧光显微镜下观察荧光标记的siRNA的转染效率,使用qRT-PCR和western blot分别检钡(?)PPARα/γ siRNA对该基因的抑制效率。用160nmol/L佛波酯孵育THP-1细胞48小时,诱导分化为巨噬细胞后,随机分为9组：(1)对照组；(2)C.pn感染浓度组：给予1×106IFUC.pn感染48h；(3)非诺贝特/罗格列酮(PPARa/y激动剂)+C.pn感染组：给予含50μmol/L非诺贝特或20μmol/L罗格列酮的培养基预孵育2h,再给予1×106IFU C.pn感染48h；(4)非诺贝特/罗格列酮组：仅给予50μmol/L非诺贝特或20μmol/L罗格列酮孵育48h；(5) MK886/GW9662(PPARa/y拮抗剂)+C.pn感染组：分别给予含1、10、20μmol/LMK886/GW9662的培养基预孵育2h,再给予1×106IFUC.pn感染48h;(6) MK886/GW9662组：仅给予20μmol/L MK886/GW9662孵育48h;(7) negative siRNA+C.pn感染组：用negative siRNA转染细胞6h,再给予1×106IFU C.pn感染48h；(8) PPARα/γ siRNA1±C.pn感染组：PPARα/γ siRNA1转染细胞6h,再给予1×106IFUC.pn感染48h;(9) PPARα/γ siRNA2+C.pn感染组：PPARa/y siRNA2转染细胞6h后,再给予1×106IFUC.pn感染48h。以上各组细胞均在负荷50μg/ml LDL的条件下进行干预处理及培养。油红O染色后研究脂滴数目和体积的变化,并进行泡沫细胞计数。用qRT-PCR和Western-blot检测各组细胞CD36、SR-A1、ACAT1、ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表达。结果：siRNAs转染效率在80%以上。与阴性对照组相比,PPARα/γ siRNA1和2转染巨噬细胞后可抑制PPARα/γ表达,筛选出后续实验所需的干预组siRNAs。与C.pn感染组比较,非诺贝特和罗格列酮不但抑制C.pn感染所诱导的SR-A1和ACAT1mRNA和蛋白表达上调(p<0.05),而且抑制C.pn感染下调ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表达(p<0.05)。相反,与C.pn感染组比较,MK886、GW9662和PPARα/γ siRNA可明显促进C.pn感染上调SR-A1和(?)ACAT1mRNA和蛋白表达,下调ABCA1和ABCG1mRNA和蛋白表达(p<0.05)。罗格列酮可逆转C.pn感染诱导CD36mRNA和蛋白表达的下调,GW9662和PPARγ siRNA则促进CD36表达下调,而非诺贝特、MK886和PPARα siRNA均对其无影响(p>0.05)。此外,油红O染色观察到,对于C.pn感染的THP-1巨噬细胞,PPARα刺激剂非诺贝特减少泡沫细胞数,PPARγ刺激剂罗格列酮同样有此效应,而MK886、GW9662和PPARα/γ siRNA则明显促进C.pn诱导THP-1源性巨噬细胞形成泡沫细胞。结论：PPARα/γ siRNA抑制THP-1源性巨噬细胞内mRNA与蛋白表达效果佳。C.pn在感染THP-1巨噬细胞后,可以减少PPARα/γ、 CD36和ABCA1/G1的基因表达,增加AC ATI和SR-A1的基因表达,而在加入PPARα/γ刺激剂后可减少C.pn对ACAT1、SR-A1和ABCA1/G1的调控影响,而PPARα/γ抑制剂和PPARα/γ siRNA则相反的效应,破坏胆固醇代谢的稳态,诱导巨噬细胞形成泡沫细胞。第三部分MAPK和PPARα/γ通路交互调控肺炎衣原体感染导致巨噬细胞形成泡沫细胞的过程目的：以THP-1源性巨噬细胞为研究对象,探讨PPARα/γ和MAPK通路对C.pn导致巨噬细胞形成泡沫细胞的影响。方法：随机将THP-1巨噬细胞分为8组：(1)对照组；(2)C.pn感染浓度组：给予1×106IFU C.pn感染48h；(3)非诺贝特/罗格列酮(PPARα/γ激动剂)+C.pn感染组：给予含50μmol/L非诺贝特或20μmol/L罗格列酮的培养基预孵育2h后,再给予1×106IFU C.pn感染48h；(4)非诺贝特/罗格列酮组：仅给予50μmol/L非诺贝特或20μmol/L罗格列酮孵育48h;(5) MK886/GW9662(PPARα/γ拮抗剂)+C.pn感染组：给予含20μmol/L MK886/GW9662的培养基预孵育2h后,再给予1×106IFUC.pn感染48h；(6)MK886/GW9662组：仅给予20μmol/L MK886/GW9662孵育48h；(7)MAPK拮抗剂+C.pn感染组：给予含20μmol/L SP600125、50μmol/L PD98059或10μmol/L SB203580的培养基预孵育2h后,再给予1×106IFU C.pn感染；(8)MAPK拮抗剂组：仅给予20μmol/L SP600125、50μmol/L PD98059或10μmol/LSB203580孵育；以上各组细胞均在负荷50μg/ml LDL的条件下进行干预处理及培养。油红O染色后研究脂滴数目和的变化,并进行泡沫细胞计数。Western-blot检测细胞JNK1/2、ERK1/2和p38磷酸化水平的改变,qRT-PCR和Western-blotting进行半定量各组细胞PPARα/γ基因表达。结果：与对照组相比,C.pn感染可使细胞内JNK1/2、ERK1/2和p38磷酸化(p<0.05)。与C.pn感染组相比,非诺贝特和罗格列酮可抑制C.pn感染诱导JNK1/2、ERE1/2和p38的磷酸化,而MK886和GW9662则升高JNK1/2、ERK1/2和p38的磷酸化水平(p<0.05)。SP600125和PD98059抑制C.pn感染下调PPARα和PPARγ的mRNA和蛋白表达(p<0.05),而SB203580对此无影响(p>0.05)。此外,油红O染色观察到,SP600125和PD98059明显抑制C.pn诱导THP-1源性巨噬细胞形成泡沫细胞,但SB203580对泡沫细胞的形成无影响。结论：肺炎衣原体诱导THP-1源性巨噬细胞后,通过MAPK和PPARα/γ交互串联通路,影响C.pn导致巨噬细胞转化成泡沫细胞的过程。