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地中海贫血又称为珠蛋白生成障碍贫血或者海洋性贫血,是一组由基因缺陷遗传因素导致的溶血性贫血类疾病。由于遗传的基因缺陷致使血红蛋白中一种或者多种珠蛋白肽链合成缺失或者不足导致的贫血或者溶血的病理状态。合成血红蛋白的珠蛋白链减少或缺失导致血红蛋白结构异常,这种含有异常血红蛋白的红细胞变形性降低,寿命缩短,在骨髓中就可能出现原位溶血,进入到外周血液循环可以提前被肝脾等破坏,导致贫血、体内铁沉积甚至发育异常。地中海贫血的治疗方法包括:一般支持治疗,高剂量输血及规律祛铁治疗,造血干细胞移植,诱导胎儿血红蛋白药物治疗和探索性的基因治疗。目前所有治疗方法中唯一有治愈希望的方法是造血干细胞移植。1981年托马斯进行了首例地贫患者的造血干细胞移植并取得成功,30多年间造血干细胞移植在全球多个中心广泛开展并取代了之前经典的输血、祛铁治疗方案。但这一方法仍然受制于HLA全相合供者缺乏、移植后GVHD和移植相关死亡。与此同时,一直以来科学家始终在寻找可以治疗地中海贫血的药物,目前FDA唯一批准用于临床治疗的口服药物是羟基脲,但由于目前对于胎儿血红蛋白表达的基因调控机理仍不清楚,目前该药物的临床疗效并不一致且存在很大的副作用,直到人们应用全基因组关联性分析(GWAS)的方法检测并分析了相关患者的HbF细胞数量和HbF水平,相关研究才取得关键性突破,证实了作为转录抑制因子的BCL11A对HbF的表达有直接负性调控作用,尤其是抑制胎儿血红蛋白表达。这使得人们可以用核酸酶进行基因编辑方面的进展在造血干细胞DNA水平通过基因打靶来失活该基因红细胞特异增强子功能,从而使后续产生的红细胞中增加胎儿血红蛋白的表达,达到缓解临床症状的目的。该实验中我们应用CRISPR/Cas9技术,在HEK293T细胞中初步进行了+55、+58、+62三个红系特异增强子的基因编辑,结果提示由于采用了Cas9D10A切口酶使得基因编辑的效率偏低。后续我们又根据最新的文献报道选择+58红系特异增强子,应用野生型Cas9配合单g RNA基因编辑方法,在K562细胞中实现了24%的突变频率,在地贫患者骨髓来源的CD34+细胞中实现了对于BCL11A基因红系增强子的基因编辑,效率达到10%。利用筛选的sgRNA和CRISPR/Cas9体系,我们实现了对地贫患者骨髓来源CD34+细胞的基因编辑。将基因编辑的CD34+造血干祖细胞体外进行红系分化后,我们在mRNA水平对胎儿血红蛋白表达进行检测,结果提示实验组较对照组的HbF mRNA表达水平提高1.9倍,在细胞水平我们用流式细胞仪检测了表达HbF细胞的比例,结果提示实验组较对照组的比例提高50%。以上结果提示基因编辑后的分化培养红细胞中胎儿血红蛋白表达增加。为了验证基因编辑后的造血干细胞造血重建能力,我们将细胞注射亚致死剂量照射的NPG小鼠进行移植实验,通过移植后检测小鼠外周血人CD45+细胞检测重建,移植8周后小鼠体内可以检测到1.38%重建,提示基因编辑的造血干细胞仍有造血重建能力。最后我们根据软件对筛选出来的sgRNA进行脱靶分析,选择预测的脱靶可能最高的六个位点设计引物,检测了基因编辑CD34+细胞中脱靶情况。通过对六个靶点进行克隆分析,未发现在脱靶位点存在基因突变。我们首次报道利用CRISPR/Cas9体系在地贫患者骨髓来源CD34+细胞中实现特定位点的基因编辑,观察到了分化后的红细胞中胎儿血红蛋白表达增加。基因编辑的CD34+细胞仍具有造血重建能力且未发现脱靶现象。综上,我们建立了一种应用CRISPR/Cas9体系对地贫患者骨髓CD34+造血干细胞细胞进行基因编辑的方法,编辑后细胞有可能通过自体造血干细胞移植重建地贫患者造血,使得缺乏HLA全相合供者的地贫患者得到治疗的机会,为后续这一新的治疗方法进行临床实验提供理论支持。