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目的:研究洛伐他汀(Lovastatin,LV)联合多柔比星(Doxorubicin,DXR)对乳腺癌干细胞(Breast cancer stem cells,BCSCs)体外生物学特性、裸鼠体内转移的影响及其可能的作用机制。方法:1、分离和鉴定乳腺癌干细胞:采用无血清超低黏附悬浮培养法从乳腺癌细胞系中培养富集出乳腺癌球形成细胞(Sphere-forming cells,SFCs)。通过免疫磁珠分选法分选出表型为CD44++/C22lo4的BBSSC。采用裸鼠皮下移植瘤模型和检测肿瘤球自我更新能力鉴定其肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)特性。2、LV联合DXR对乳腺癌干细胞体外生物学特性的影响:使用LV单独或联合乳腺癌治疗常用化疗药物多柔比星(Doxorubicin,DXR)、环磷酰胺(Cyclophosphamide,CPA)、紫杉醇(Paclitaxel,PTX)或顺铂(Cisplatin,DDP)处理BCSCs后,用Alamar Blue法检测细胞活力;用肿瘤球形成实验检测细胞成球能力。3、LV对乳腺癌干细胞内DXR聚集量的影响:用DXR联合不同浓度LV处理BCSCs,激光共聚焦显微镜观察BCSCs内DXR荧光聚集量。4、LV联合DXR对乳腺癌干细胞体内转移的影响:经尾静脉注射乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs构建裸鼠体内转移模型,细胞注射后第二天给予单独LV(2mg/kg)或联合DXR(1 mg/kg)药物处理,每周给药两次持续给药七周。实验结束时收取裸鼠肝脏和肺脏组织并计数肝肺脏组织表面肿瘤转移结节数目;组织经常规固定及石蜡包埋后进行组织病理学分析。5、LV对乳腺癌干细胞中ABC转运蛋白的影响:用不同浓度LV处理 BCSCs,qPCR 和 western blotting 分别检测 ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白相关基因mRNA表达水平和蛋白水平;流式细胞术测定BCSCs内MDR1/P-gp/ABCB1底物Calcein-AM的荧光强度。6、LV对乳腺痛干细胞自噬的影响:体外,使用不同浓度LV处理BCSCs,透射电子显微镜观察自噬小体形成;免疫荧光检测细胞内LC3荧光变化情况;Western blotting检测自噬相关蛋白(Akt、AMPK、mTOR、LC3和Bcl-2/Bcl-xL)水平。体内,经乳腺脂肪垫注射乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs建立裸鼠移植瘤原位模型,细胞注射后两周用溶媒或LV(2 mg/kg)处理,每周给药两次持续给药三周;实验结束时取肿瘤组织,肿瘤组织经常规石蜡包埋,免疫组化分析检测自噬相关蛋白(p62、Akt和AMPK)水平。此外,使用自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)联合 LV 处理 BCSCs,检测 3-MA 能否逆转LV对BCSCs细胞活力的抑制作用。结果:1、分离和鉴定乳腺癌干细胞:经无血清超低粘附悬浮培养法和免疫磁珠分选法成功分离富集出CD44+/CD24low BCSCs,且其肿瘤球形成能力至少能够保持10代；在裸鼠皮下移植瘤实验中,MDA-MB-231 CSCs的成瘤能力比其亲本细胞高两个数量级。表明我们分离富集的BCSCs具有CSC特性。2、LV协同性增加DXR对乳腺癌干细胞体外生物学特性的抑制作用:相比于其他化疗药物,DXR联合LV能够协同性抑制乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs、MDA-MB-453 CSCs 和 BT-549 CSCs 的细胞活力且使用剂量更低。在相同剂量下,LV联合DXR能够协同性抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-453的肿瘤球形成能力。3、LV促进DXR在乳腺癌干细胞内聚集:随着LV浓度的增加,LV能够增加乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs和4T1 CSCs内DXR荧光聚集量,表明LV能够促进DXR在BCSCs内聚集。4、LV联合DXR协同性抑制乳腺癌干细胞体内肝转移:在裸鼠乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs转移模型中,相比于对照组和单独用药组,LV联合DXR能够显著降低肝脏组织表面转移结节数目；且H&E也表明,相比于对照组和单独用药组,LV联合DXR组肝脏组织上远处转移肿瘤组织面积和数目明显减少。5、LV抑制乳腺癌干细胞中BCRP/ABCG2水平:在乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs 中,LV 能够明显下调 BCRP/ABCG2 的 mRNA表达水平,上调MDR1/P-gp的mRNA表达水平;在乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs和 4T1 CSCs 中,LV 能够显著降低BCRP/ABCG2蛋白水平；此外,流式细胞术显示,LV能够轻微调节乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs 和 4T1 CSCs 内 MDR1/P-gp 底物 Calcein-AM 的荧光强度,但这种调节作用不显著。6、LV诱导乳腺癌干细胞自噬:在体外,LV能够增加乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs内自噬小体数目;LV能够增加乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs、4T1 CSCs 和 MDA-MB-453 CSCs 内 LC3 荧光点状聚集;此外,在乳腺癌干细胞MDA-MB-231CSCs和4T1CSCs中,LV能够增加自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,增加自噬相关信号通路蛋白 AMPKThr172 水平、降低 AktSer473、mTORSer2448 和 Bcl-2/Bcl-xL蛋白水平。在体内,LV能够降低自噬相关蛋白p62水平,增加自噬相关信号通路蛋白AMPKThr172水平、降低AktSer473水平。以上结果表明,在体内外,LV能够诱导BCSCs自噬性细胞死亡。此外,自噬抑制剂3-MA能够显著逆转LV对乳腺癌干细胞MDA-MB-231 CSCs细胞活力的抑制作用。结论:1.LV联合DXR协同性抑制BCSCs细胞活力及肿瘤球形成能力;LV促进DXR在BCSCs内聚集。2.LV联合DXR协同性抑制BCSCs体内肝转移。3.LV通过抑制BCRP/ABCG2药物外排和诱导自噬性细胞死亡增加BCSCs对DXR的化疗敏感性。