作为生化分析领域提高检测灵敏度的一个重要的途径,核酸放大方法广泛应用于科学研究、临床医学和军事法医鉴定等领域,并备受广大研究者的关注。尤其在生物化学研究层面,核酸放大方法更是被广泛应用在DNA、RNA、细胞、蛋白质等生物分子的传感标记检测识别过程中,能够简便快速的积累核酸序列,实现信号的输出与放大,提高检测物质的灵敏度。本论文本着寻求更灵敏、更高度选择性分析检测方法的目的,基于常见的等温扩增手段杂交链式反应(HCR)和环介导等温扩增技术(LAMP)优势,建立了一些新型生物传感平台来对端粒酶活性、丙型肝炎病毒目标物进行分析与测定。相对于传统的检测方法,本论文建立的分析平台手段实验成本低、灵敏度高、响应速度快,并通过对实际检测对象的分析,初步验证了这些方法的可行性和实用性。论文包括如下两个方面的工作:端粒酶(Telomerase),作为一种RNA-蛋白质复合物的逆转录酶,促进端粒在染色体分裂复制过程中不断延伸,维持染色体的完整性。近年来,研究发现肿瘤标记物端粒酶活性的检测对于癌症的早期临床诊断、生物医学上研发以端粒酶为靶向分子的抗肿瘤药物等方面都具有重大意义。在第2章,我们利用一种毒性更低、效率更高的转染试剂Lipofectamine 3000脂质体,将端粒酶引物探针导入细胞,结合核酸无酶信号放大技术HCR杂交链式反应,建立一种新型生物传感荧光分析方法用于细胞体内端粒酶活性的检测。实验设计如下:H1发夹探针3’末端标有Cy3荧光基团作为信号探针,其荧光团能够被BHQ2猝灭基团猝灭。当目标物端粒酶不存在的情况下,HCR引物序列被封闭在发夹结构中,不能触发HCR放大反应。在加入端粒酶的情况下,引物探针在其3’端末端不断延伸产生端粒重复序列,这些端粒重复序列能够与H1探针5’端序列互补配对,触发HCR反应,荧光强度增强。随着HCR反应的进行,实现荧光信号的放大,实现了端粒酶在单个细胞中的荧光成像,检测限可达158个HeLa细胞。本章所建立的方法简便、高效,同时具有很好的选择特异性。因此该方法有望为未来涉及端粒酶相关的药物筛选、肿瘤生物标志物发现和癌症诊断研究提供一个有利的分析检测平台。丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV),一种引起慢性肝炎和进行性肝纤维化的单链RNA病毒。每年全世界有将近3%的人感染HCV病毒,30%的患者最终发展为晚期肝癌。在第3章,我们将结合BEAMing技术设计一种更为高效、高通量的液滴数字化检测方法,结合环介导等温扩增(LAMP)的优势,实现对丙型肝炎病毒感染的监测与分析。BEAMing(beads,emulsions,amplification and magnetics),一种建立在磁珠和微乳液PCR扩增上的技术,可用于对数以百万计的分子进行计数。本章整个过程利用液滴隔室内的磁珠分别捕获原始目标DNA分子的拷贝序列,再在各个单独乳液区室中进行LAMP扩增反应,利用LAMP扩增技术特异性高、高效灵敏等优势,扩增后每个微乳液滴反应室中含有一个捕获了目标原始目标DNA分子成千上万个拷贝的磁珠,再利用流式细胞仪对磁珠捕获的LAMP扩增目标产物荧光链进行计数。因为每个磁珠捕获的目标链经过LAMP扩增后,产生成千上万个相同序列的分子,通过杂交获得的信噪比非常高。运用流式细胞仪可以在短短数分钟内对这些磁珠计数分析,实现高通量的检测。该方法灵敏、高效,日后可为目标分子实现高通量测序提供更有利的方式。