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研究背景缝隙连接(gap junction)是沟通相邻细胞间离子及小分子物质交换的直接通道,缝隙连接对细胞的增殖、分化、发育等生命活动中起着重要作用。他汀类药物,即3-羟3-甲基戊二酸甲酰辅酶A还原酶抑制剂【3-hydroxy-3-methylglutaryl-cooenzymeA(HMG-CoA)reductase inhibitors】,是临床上广泛应用的血脂调节药物,许多临床试验表明,他汀类药物在一、二级预防中明显降低动脉粥样硬化疾病的发生率和死亡率。大量研究表明他汀类药物还具有多种非降脂作用。有研究表明,他汀类药物可以抑制平滑肌细胞增殖和迁移,近来有研究显示,他汀类药物可以减少小鼠及兔动脉粥样硬化病变中缝隙连接蛋白CX43和CX40的表达,但是他汀类药物对缝隙连接介导的细胞间通讯的影响尚未见报道。第一部分洛伐他汀对大鼠主动脉平滑肌细胞缝隙连接胞间通讯功能的影响目的探讨洛伐他汀对大鼠的主动脉平滑肌细胞迁移和缝隙连接介导的胞间通讯的影响,阐明缝隙连接胞间通讯在细胞迁移中的重要作用及他汀抑制平滑肌细胞迁移的可能机理之一。方法1、细胞培养:取大鼠主动脉平滑肌细胞按组织片贴壁法培养。2、大鼠主动脉平滑肌细胞静默处理后,利用Transwell小室(Transwells assay)分别在无血清培养基(正常对照组)和含0.08,0.4,2,or 10umol/L洛伐他汀无血清培养基中培养,评估细胞的迁移情况。3、大鼠主动脉平滑肌细胞在无血清培养基(正常对照组)和含0.08,0.4,2,or10umol/L洛伐他汀无血清培养基中培养48小时后,利用光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)测定GJIC水平。结果1、Transwell小室测洛伐他汀对主动脉平滑肌细胞迁移的作用情况的研究,结果显示:洛伐他汀对细胞迁移的抑制作用呈浓度依赖性;在200倍显微镜下计数Transwell膜底面的迁移细胞,正常对照组迁移细胞数为110±26,加入0.08mmol/L洛伐他汀组为85±31(P＞0.05),加入0.4mmol/L洛伐他汀组为72±24(P＜0.05),加入2mmol/L洛伐他汀组为62±18(P＜0.01),加入10mmol/L洛伐他汀组为58±19(P＜0.01)。2、FRAP方法研究大鼠主动脉平滑肌细胞GJIC功能变化,结果显示:荧光染色大鼠主动脉平滑肌细胞呈单层贴壁生长,正常对照组中,经瞬间漂白后细胞内荧光强度明显变弱,随着时间的推移,荧光逐渐恢复,至第5min时,可见荧光强度明显恢复,平均荧光恢复率为36.11%±10.53%,不同浓度的洛伐他汀(0.08mmol/L,0.4mmol/L,2mmol/L,10mmol/L)作用于大鼠主动脉平滑肌细胞48小时后,明显降低细胞的荧光恢复率,其荧光恢复率分别为30.20±7.63(P＞0.05),27.01±6.60(P＜0.05),25.95±7.74(P＜0.01),和24.38%±4.84%(P＜0.01),且呈浓度依赖关系。结论1、洛伐他汀可抑制大鼠主动脉平滑肌细胞迁移,其作用呈浓度依赖性;2、本研究首次采用FRAP技术从功能上证明洛伐他汀可抑制大鼠平滑肌细胞的缝隙连接胞间通讯;3、洛伐他汀抑制细胞间通讯作用可能是抑制细胞迁移的机制之一。第二部分他汀药物对兔主动脉平滑肌细胞缝隙连接通讯的抑制作用目的探讨洛伐他汀和普伐他汀对兔主动脉平滑肌细胞迁移和缝隙连接介导的胞间通讯的影响,比较水溶性他汀药物与脂溶性药物的作用,阐明缝隙连接胞间通讯在细胞迁移中的重要作用及他汀抑制平滑肌细胞迁移的可能机理之一方法1、细胞培养:取家兔主动脉平滑肌细胞按酶消化法方法培养。2、兔主动脉平滑肌细胞静默处理后,利用Transwell小室(Transwells assay)分别在无血清培养基(正常对照)以及含0.08,0.4,2,or 10umol/L洛伐他汀或普伐他汀的无血清培养基中培养,评估细胞的迁移情况。3、兔主动脉平滑肌细胞在无血清培养基(正常对照)含0.08,0.4,2,or 10umol/L洛伐他汀培或普伐他汀的无血清培养基中培养48小时后,利用光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)测定GJIC水平。结果1、洛伐他汀和普伐他汀均可明显抑制兔主动脉平滑肌细胞的迁移能力,10mmol/L洛伐他汀和普伐他汀作用下,在200倍显微镜下计数Transwell膜底面的迁移细胞分别为43±7和81±15,而正常对照为120±27;2、洛伐他汀和普伐他汀均可明显抑制兔主动脉平滑肌细胞的缝隙连接通讯功能,10mmol/L洛伐他汀和普伐他汀作用下,兔主动脉平滑肌细胞的荧光恢复率分别为17.83%±6.49%and 29.54%±8.13%,而正常对照为53.4%±13.84%;3、在2mmol/L和10mmol/L的浓度下,脂溶性的洛伐他汀对兔主动脉平滑肌细胞迁移能力和缝隙连接通讯功能的抑制作用强于水溶性的普伐他汀(P＜0.05)结论1、他汀药物可抑制兔主动脉平滑肌细胞迁移能力和缝隙连接通讯功能,其作用呈浓度依赖性;2、脂溶性他汀药物(洛伐他汀)对兔主动脉平滑肌细胞迁移能力和缝隙连接通讯功能的抑制作用强于水溶性他汀药物(普伐他汀)3、他汀药物抑制细胞间通讯作用可能是抑制细胞迁移的机制之一。