背景和目的:乳腺癌作为临床上极为常见的恶性实体肿瘤,其在女性恶性肿瘤致死率内位于第一位。乳腺癌的发病诱因较为复杂,其恶性程度较高,并且容易发生转移,这给乳腺癌的治疗带来巨大的挑战。随着近些年来人们对乳腺癌的不断研究,乳腺癌的分子发生机制越来越受到广泛关注。放疗和手术治疗等是临床上十分常见的乳腺癌治疗途径,并且伴随着这些治疗手段的逐渐进步,乳腺癌患者生存时间也得到较大的提高。由于很多乳腺癌患者在早期已经发生了转移,手术切除并不能完全根治,而放疗、化疗等治疗方法副作用大、对患者自身条件要求较高,积极寻找有效的治疗途径,延长乳腺癌患者的生存时间是目前面临的问题。micro RNA（miRNA）是一类长度为15～22个核苷酸的非编码RNA的大家庭,其已经成为了调控基因转录表达研究领域中的热点,很多研究证据已经证明,miRNA在基因转录后表达中发挥关键作用。在哺乳动物体中,有50%的miRNA能够调控相关编码蛋白质表达的相关基因的活性。人体组织中,miRNA几乎在所有细胞中表达,而且miRNA表达水平的不同还和多数疾病的发生关系十分密切。另外,miRNA本身也与机体中多种基因的表达有关系,主要表现为miRNA的表达不同和代谢方式的改变。miRNA在影响下游基因的表达过程中,可以和含有靶基因3’UTR端特异性的互补结合位点作用,而且同一个miRNA含有了很多结合序列,也正是因为如此,miRNA在多种基因表达中发挥了作用,同一个基因也受到很多miRNA的调控作用,因此,miRNA和靶基因之间的这种相互作用构成了复杂的生命活动和病理进程。miRNA还和肿瘤的关系十分密切,肿瘤组织内miRNA的表达改变往往提示着某些病理变化的特点,这些miRNA多数已经参与了肿瘤的转移、生长过程,miRNA也已经成为了抑制肿瘤中靶向基因的热点。mi R-338-3p已经被发现在人体组织内广泛的表达,和肿瘤的进展如结直肠癌、卵巢癌等有关,mi R-338-3p能够抑制肿瘤细胞的恶性表型。目前对mi R-338-3p在乳腺癌进展中的作用机制还不明确。Microrchidia（MORC）是高度保守的核蛋白超家族,参与多种生物学过程,包括细胞增殖、细胞衰老、DNA损伤修复,其调节异常与癌症相关。前期的预实验发现mi R-338-3p与MORC家族CW型锌指结构蛋白4（MORC4）的3′UTR端有互补结合位点。查阅文献发现,MORC4在肿瘤组织中过度表达,其可以促进肿瘤进展。黄芩是一种传统中药,有很多功效,如清热、解毒、止血等。黄芩苷是从黄芩中提取的一种有效活性成分,它属于黄酮类,有明显的消炎、抗菌、抗氧化功效,在脑缺血再灌注引起的脑损伤以及肝脏相关损伤中有十分明显的改善作用。黄芩苷还具备明显的抗肿瘤功效,其能够降低骨肉瘤、肺癌等多种肿瘤细胞的生长和转移潜能,激活细胞凋亡。目前已知黄芩苷可以抑制乳腺癌恶性进展,但对其具体的作用机制还不明确。很多研究发现,黄芩苷可以通过作用于miRNA的表达而发挥作用。本次实验探讨黄芩苷通过mi R-338-3p对MORC家族CW型锌指结构蛋白4（MORC4）的靶向调控作用影响乳腺癌进展的作用机制,实验分成二个部分,第一部分探讨黄芩苷通过mi R-338-3p对MORC4靶向调控作用影响乳腺癌细胞凋亡、侵袭和迁移,第二部分探讨黄芩苷对乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响。第一部分黄芩苷通过mi R-338-3p对MORC4靶向调控作用影响乳腺癌细胞凋亡、侵袭和迁移方法:1.分别用0、25、50、100、200μM的黄芩苷处理正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7,细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞24h增殖活性变化。2.用浓度为100μM的黄芩苷将正常的乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7进行处理,然后利用CCK-8法分析检测细胞在12、24、48h增殖活性的变化。3.采用q RT-PCR方法分析并检测了收集的65例癌旁组织和乳腺癌组织内mi R-338-3p的表达差异。4.采用q RT-PCR方法分析并检测了正常的乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7内mi R-338-3p的表达差异。5.分别用0、25、50、100、200μM的黄芩苷处理乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231,q RT-PCR检测mi R-338-3p表达变化。6.mi R-338-3p inhibitor、inhibitor control分别转染到了乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中,然后给予浓度为100μM的黄芩苷刺激24 h,利用Transwell小室分析并检测细胞的侵袭和迁移水平,利用流式细胞术分析并检测细胞的凋亡。7.采用生物信息学在线软件分析并预测了mi R-338-3p靶基因,然后用荧光素酶报告系统以及RIP实验对二者的关系进行了验证。8.采用q RT-PCR方法分析并检测了收集的65例癌旁组织以及对应的乳腺癌组织内MORC4 m RNA的表达差异。9.采用q RT-PCR方法分析并检测了正常的乳腺上皮细胞MCF-10A以及乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7内MORC4 m RNA的表达差异。10.分别用0、25、50、100、200μM的黄芩苷处理乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231,q RT-PCR检测MORC4 m RNA表达变化。11.在乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中转染mi R-338-3p mimics、mimics control、mi R-338-3p inhibitor、inhibitor control,采用Western blot方法分析并检测了细胞中MORC4蛋白的表达差异。12.在乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中分别共转染mi R-338-3p mimics和pc DNA、共转染mi R-338-3p mimics和pc DNA-MORC4,Transwell小室检测细胞迁移和侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:1.25、50、100、200μM的黄芩苷处理以后的正常乳腺上皮细胞MCF-10A的增殖活性没有变化;50、100、200μM的黄芩苷处理以后的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖活性均明显下降;25μM的黄芩苷处理后的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231增殖活性没有明显变化。2.100μM的黄芩苷处理12、24、48h以后的正常乳腺上皮细胞MCF-10A的增殖活性没有变化;浓度为100μM的黄芩苷刺激12、24、48h之后的乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7的增殖活性均出现下降趋势。3.乳腺癌组织中的mi R-338-3p的表达水平明显比癌旁组织中低。4.乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7内mi R-338-3p的表达量较正常的乳腺上皮细胞MCF-10A降低。5.50、100、200μM的黄芩苷处理后的乳腺癌细胞中mi R-338-3p的表达水平明显提高,25μM的黄芩苷处理以后的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中mi R-338-3p表达水平没有明显变化。6.黄芩苷处理后的乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移、侵袭能力均明显降低,细胞凋亡水平增加;与转染了inhibitor control相比,转染了mi R-338-3p inhibitor之后的乳腺癌细胞MDA-MB-231在经过黄芩苷的处理以后,细胞的迁移、侵袭能力升高,细胞的凋亡减少。7.mi R-338-3p和MORC4互为靶向关系。8.乳腺癌组织中MORC4 m RNA的表达水平明显比癌旁组织中高。9.乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7内MORC4 m RNA的表达量较正常的乳腺上皮细胞MCF-10A明显升高。10.50、100、200μM的黄芩苷对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中MORC4 m RNA表达有抑制作用,25μM的黄芩苷对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中MORC4 m RNA表达没有影响。11.转染了mi R-338-3p mimics以后的乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中的MORC4蛋白水平较转染了mimics control的细胞明显降低;转染了mi R-338-3p inhibitor以后的乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7中的MORC4蛋白水平较转染了inhibitor control以后的细胞明显升高。12.与共同转染了mi R-338-3p mimics、pc DNA以后的细胞比,共同转染了mi R-338-3p mimics以及pc DNA-MORC4之后的乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭能力增强,凋亡减弱。第二部分黄芩苷对乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响方法:1.乳腺癌细胞MCF-7被接种于裸鼠的皮下,并且在皮下注射阴性对照慢病毒表达载体以及mi R-338-3pinhibitor慢病毒表达载体,细胞接种第7天起每天灌胃黄芩苷水溶液（100mg/kg）,连续用药14天,测量肿瘤体积,接种后35d,取移植瘤组织,称量移植瘤重量。2.取各移植瘤组织,利用q RT-PCR方法分析并检测了mi R-338-3p的表达,利用Western blot方法分析并检测了MMP-2、MORC4、Bcl-2、MMP-9、Bax蛋白的表达差异。结果:1.黄芩苷灌胃处理的裸鼠移植瘤生长体积和重量明显下降;与皮下注射阴性对照慢病毒表达载体相比,皮下注射mi R-338-3pinhibitor慢病毒表达载体的裸鼠经过黄芩苷灌胃后,裸鼠移植瘤生长体积和重量明显增加。2.在经过黄芩苷灌胃处理之后的裸鼠移植瘤组织内发现了mi R-338-3p的表达升高,而且MMP-2、MORC4、Bcl-2、MMP-9的蛋白表达水平减弱,Bax蛋白表达水平增加;与皮下注射阴性对照慢病毒表达载体相比,皮下注射mi R-338-3p inhibitor慢病毒表达载体的裸鼠经过黄芩苷灌胃后,裸鼠移植瘤组织中mi R-338-3p表达水平降低,MORC4、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax蛋白表达水平下降。结论:1.黄芩苷可以抑制乳腺癌细胞增殖活性,提高乳腺癌细胞中mi R-338-3p表达水平。2.mi R-338-3p靶向负调控乳腺癌细胞中MORC4表达。3.黄芩苷通过mi R-338-3p抑制乳腺癌细胞中MORC4表达。4.黄芩苷通过mi R-338-3p抑制乳腺癌细胞裸鼠移植瘤生长。