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硫氧还蛋白系统是生物体内重要的抗氧化系统之一,主要包含有硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和NADPH,该系统通过调节酶活性、转录因子、各种胁迫应答和信号传导等,在生物抗逆系统中起着重要的作用。南极由于其独有的地理及气候特征,形成了一个干燥、酷寒、强辐射的自然环境,蕴育了丰富的微生物资源。在长期的进化和生长过程中,微生物形成了极为独特的基因资源、遗传背景及新的代谢特征。本论文以南极海冰细菌Pseudoalteromonas sp.为材料,对硫氧还蛋白系统中两个重要成员Trx与TrxR的基因进行了克隆、异源表达以及活性研究,以期进一步完善南极微生物低温适应性的分子机制,获得具有自主知识产权的功能基因,为抗逆生物遗传育种提供新的基因。(1)在前期从海冰细菌Pseudoalteromonas sp.ANT178中克隆出Trx全长基因(PsTrx)的基础上,本论文利用生物信息学方法对PsTrx进行了分析和预测。该基因大小为327bp,编码108个氨基酸,理论分子量为11.9kDa,等电点pI=4.50,推测其关键活性位点为Cys33和Cys36,结构模型中含4个α-螺旋和5个β-折叠。将PsTrx基因转入E.coli BL21中,实现了异源表达,并对该重组蛋白进行了Ni-亲和层析纯化及活性测定。结果表明,经纯化后的Trx重组蛋白比活力为96.67U/mg,纯化倍数达22.22倍,总回收率为27.26%;其最适反应温度为25℃,最适反应pH为7.0。PsTrx在高盐(2M NaCl)环境中仍保留一定的活性。变性剂SDS对蛋白活性的抑制力最强,相对活性仅为22.94%,氧化剂H2O2对PsTrx的抑制作用最小,相对活性可高达95.36%。(2)PsTrx基因转入E.coli BL21后,重组菌株耐盐性显著提高,在盐度为9%培养条件下,其最大OD600吸光值可以达到1.316,而野生型大肠杆菌的OD600仅为0.393。利用FQ-PCR相对定量2-△△Ct法测定不同盐度下海冰细菌PsTrx表达情况,高盐度下(5%-9%NaCl)的PsTrx表达量高于对照组(3.3%NaCl),其中9%盐度下的表达量是对照组的2.5倍,这表明PsTrx基因在菌体的耐盐机制中起着重要作用,进而可为耐盐遗传育种提供新的基因。(3)从菌株Pseudoalteromonas sp.ANT178克隆出TrxR基因,命名为PsTrxR,该基因具有完整的基因阅读框,大小为951bp。生物信息学分析表明该基因编码316个氨基酸,PsTrxR的理论分子量为33.7kDa,等电点为4.98,推断的活性位点为Cys136和Cys139,蛋白结构内含5个α-螺旋和18个β-折叠。将PsTrxR转入E.coli BL21中成功表达,利用Ni-亲和层析对重组蛋白进行纯化,重组蛋白比活力为29.71U/mg,总纯化倍数达26.29倍,总回收率为35.75%。重组PsTrxR的最适反应温度为20℃,最适反应pH为7.0,该酶在50℃处理40min后,酶活性下降至66%。以DTNB为底物测定酶动力学参数Km和Vmax分别为1.15mM和5.17nmol/mL/min。变性剂DTT对PsTrxR酶活的抑制作用为100%,金属离子Zn2+对酶的抑制作用小,相对剩余活性可达71.38%。