多种临床疾病如严重创伤、出血性休克、严重烧伤、脓毒症、肠梗阻、肠移植、肠系膜动脉栓塞等，都会发生肠道缺血再灌注(I/R)这一基础病理生理学改变，继而引起肠屏障功能障碍，导致肠道渗透性增加、紧密连接蛋白破坏、细菌和内毒素易位，诱发全身炎症反应综合征(SIRS)和多脏器功能障碍综合征(MODS)。　　 I/R损伤后，肠道上皮细胞将发生移行、增殖、分化成熟等一系列修复过程；同时，间质细胞和血细胞释放各种生长因子参与肠上皮损伤的修复。有研究表明，表皮生长因子(EGF)在调节肠道上皮细胞增殖和存活中起着重要作用。目前关于EGF对小肠I/R模型的研究仅限于其减少肠道通透性、保护器官功能方面的影响，关于其对细胞增殖和肠粘膜屏障损伤修复的作用，尚无系统性研究。　　 在本研究中，我们采用大鼠作为动物模型，研究不同I/R损伤程度下肠道隐窝细胞增殖的变化特征，及其与肠粘膜屏障改变的关系。探讨给予外源性EGF后，对I/R损伤后细胞增殖和肠粘膜屏障功能修复的作用，为促肠粘膜损伤修复的治疗提供实验研究基础。　　 第一部分I/R损伤后肠粘膜屏障损伤修复中小肠隐窝细胞增殖的作用　　 研究1.1 不同I/R损伤程度下肠粘膜结构的损伤修复　　 目的：在不同I/R损伤程度下，观察肠粘膜结构损伤修复的过程。　　 方法：选用健康SD大鼠90只，随机分为轻度I/R损伤组(夹闭肠系膜上动脉30min，n=45)和重度I/R损伤组(夹闭肠系膜上动脉60min，n=45)。根据再灌注时间0h，0.5 h，1h，2h，4h，6h，12 h，24 h，48h每组随机5只。另假手术组(对照组)大鼠5只。于各再灌注时间点处死大鼠，取近端空肠和末端回肠组织，用Chius评分评估组织病理学改变；TUNEL法检测细胞凋亡程度。用Image-Pro Plus6.0图像分析软件计数10个高倍镜(×400)下阳性细胞总数，以均数±标准差表示，数据采用SPSS18.0统计软件进行分析，各组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有显著统计学意义。　　 结果：与对照组相比，缺血性损伤后早期(R0h)即出现明显的组织结构损害，轻度损伤组于R12h-24h基本恢复，重度损伤组于R24h-48h基本恢复。与对照组相比，缺血性损伤后细胞凋亡数并未即刻增加，轻度损伤组在R1h-6h时细胞凋亡明显，随后逐渐降至正常；重度损伤组在R2h-12h时明显，后渐降至正常。　　 结论：肠道缺血性损伤后早期即发生严重的组织形态学破坏，与轻度损伤组相比，重度损伤组的组织结构恢复较慢，细胞凋亡持续时间较长。　　 研究1.2 不同I/R损伤程度下小肠隐窝细胞增殖的变化特征　　 目的：在不同I/R损伤程度下，观察肠粘膜屏障损伤修复过程中肠道隐窝细胞增殖的变化特征。　　 方法：实验大鼠分组同研究1.1。于各再灌注时间点处死大鼠，取近端空肠和末端回肠组织，用免疫组化方法检测各组动物小肠隐窝细胞增殖程度(Ki67，Musashi-1)。用Image-Pro Plus6.0图像分析软件计数高倍镜(×400)下的增殖指数(阳性细胞数/μm2)，以均数±标准差表示，数据采用SPSS18.0统计软件进行分析，各组间计量资料比较用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有显著统计学意义。　　 结果：与对照组相比，轻度损伤组隐窝细胞增殖指数并未于缺血性损伤后即刻增高，轻度损伤组的增殖指数于R1h-2h时明显升高，随后逐渐降至正常；重度损伤组的增殖水平于R1h-6h时明显升高，后渐降至正常。　　 结论：I/R损伤后R1h左右，肠道隐窝细胞增殖活跃，重度损伤组隐窝细胞增殖率增高的持续时间较轻度损伤组长(R1h-6h vs.R1h-2h)，随后细胞增殖率趋于正常。　　 研究1.3 不同I/R损伤程度下小肠隐窝细胞增殖与肠粘膜屏障功能损伤修复的关系　　 目的：在不同I/R损伤程度下，观察肠粘膜屏障功能损伤修复的过程，探索其与隐窝细胞增殖变化特征之间的关系。　　 方法：实验大鼠分组同研究1.1。取近端空肠、末端回肠粘膜，并抽取门静脉血。用Western法检测轻度损伤组和重度损伤组中R0h、R1h、R2h、R4h、R6h和对照组的小肠粘膜组织紧密连接蛋白(TJs)ZO-1和Occludin表达，用ELISA法检测各组大鼠血清中D-乳酸浓度。于各再灌注时间点前30min结扎10cm末端回肠，灌注0.5ml20mg/ml FITC-Dextran-4(FD4，MW4400)溶液，30min后取门静脉血，用荧光分光光度计测血清中荧光强度。Western条带用Quantity One4.4软件分析。各检测指标以均数±标准差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，各检测指标组间计量资料比较采用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有显著统计学意义。　　 结果：与对照组相比，在肠道缺血性损伤后早期(R0h)血清中FD4和D-乳酸浓度明显增高，细胞间TJs破坏。与轻度损伤组相比，重度损伤组的FD4浓度增高持续时间较长(R0-2h vs.R0-1h)，D-乳酸的增高程度较显著(360.67±69.41μmol/L vs.238.15±16.42μmol/L，P<0.05)，TJs恢复较慢(R6h vs.R2h)。　　 结论：肠道缺血性损伤后早期即有渗透性增高及肠粘膜屏障功能损伤，与轻度损伤组相比，重度损伤组的屏障功能损伤程度较重，且修复缓慢。结合研究1.2，随着隐窝细胞增殖率的升高，增高的肠道渗透性明显降低，并伴有显著的TJs修复。　　 研究1.4 不同I/R损伤程度下肠粘膜屏障功能与炎性反应的关系　　 目的：不同的I/R损伤程度下，检测炎性反应程度及其与肠粘膜屏障功能变化之间的关系。　　 方法：实验大鼠分组同研究1.1。抽取门静脉血，用ELISA法检测血清中IL-6浓度。数据以均数±标准差表示，用SPSS18.0统计软件进行分析，各组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，渗透性与炎性反应因子间相关性用双变量相关分析(Spearman)，以P<0.05为差异有显著统计学意义。　　 结果：与对照组相比，血清中炎症因子IL-6浓度在肠道缺血性损伤后早期(R0.5h)即有明显增高(P<0.01)。重度损伤组炎性反应增高的持续时间较轻度损伤组长(R0.5h-2h vs.R0.5h)。FD4、D-乳酸和IL-6的浓度变化趋势相似，其中，FD4与IL-6浓度在轻/重度损伤组均呈显著相关性(Spearman相关系数=0.428/0.373，P<0.05)。　　 结论：肠道缺血性损伤后早期即有炎症反应增强，其持续时间随损伤严重度增加而延长，并与肠道渗透性改变相关。　　 第一部分小结：　　 在I/R损伤后早期，肠道结构和功能严重破坏，肠道渗透性明显增高，炎性反应增强，紧密连接蛋白破坏，肠粘膜屏障功能损伤；随着隐窝细胞增殖活跃(R1h)，肠粘膜屏障的通透性明显降低，紧密连接蛋白的招募和功能逐渐恢复，炎症反应减轻；伴随着隐窝细胞增殖和凋亡水平趋于正常，肠粘膜结构逐渐恢复。随着缺血性损伤的严重度增加，隐窝细胞增殖活跃的持续时间加长，肠道结构和功能损伤的程度加重、持续时间延长，且修复缓慢。肠道I/R损伤后，隐窝细胞的增殖在肠粘膜屏障修复中起着重要作用。　　 第二部分、外源性rh-EGF对I/R损伤后肠粘膜屏障损伤修复的作用　　 研究2.1 外源性rh-EGF对I/R损伤后早期肠粘膜结构损伤的影响　　 目的：观察特定I/R损伤时，不同剂量、不同时机应用外源性EGF对肠粘膜结构损伤的影响。　　 方法：将36只SD大鼠随机分为假手术组(对照组)，模型组(I/R组)，大剂量预处理组(Pre-L组，EGF500μg/kg，缺血前5min注射)，小剂量预处理组(Pre-S组，EGF50μg/kg，缺血前Smin注射)，大剂量后处理组(Post-L组，EGF500μg/kg，再灌注后5min注射)和小剂量后处理组(Post-S组，EGF50μg/kg，再灌注后5min注射)，每组各6只。模型组和治疗组大鼠于缺血30min再灌注30min时，取近端空肠和末端回肠组织，以Chius评分评估组织病理学改变。数据以均数±标准差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，各组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有显著统计学意义。　　 结果：与对照组相比，I/R组大鼠出现明显的肠粘膜损伤，Chiu评分增高(P<0.05)；与I/R组比较，小肠粘膜病理学损伤在Pre-L、Pre-S和Post-L组都有明显改善(P<0.05)，而在Post-S组无明显改变。　　 结论：在缺血性损伤后早期，EGF对大鼠小肠肠粘膜屏障结构损伤具有防护作用。　　 研究2.2 外源性rh-EGF对I/R损伤后早期隐窝细胞增殖的影响　　 目的：观察特定I/R损伤时，不同剂量、不同时机应用外源性EGF对小肠隐窝细胞增殖的影响。　　 方法：实验大鼠分组同研究2.1。模型组和治疗组大鼠于缺血30min再灌注30min时，分别取近端空肠和末端回肠组织，用免疫组化方法检测各组动物小肠隐窝细胞增殖程度(Ki67)。采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件计数高倍镜(×400)下的增殖指数(阳性细胞数/μm2)，以均数±标准差表示，数据采用SPSS18.0统计软件进行分析，各组间计量资料比较用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有显著统计学意义。　　 结果：与对照组相比，I/R组大鼠的隐窝细胞增殖程度无明显改变；与I/R组比较，小肠细胞增殖水平在Pre-L、Pre-S和Post-L组都有明显增高(P<0.05)，而在Post-S组没有显著改变。　　 结论：在缺血性损伤后早期，EGF对大鼠小肠隐窝细胞有促增殖作用。　　 研究2.3 外源性rh-EGF对I/R损伤后早期肠粘膜屏障功能损伤修复的影响　　 目的：观察特定I/R损伤时，不同剂量、不同时机应用外源性EGF对肠粘膜功能损伤修复的影响。　　 方法：实验大鼠分组同研究2.1。模型组和治疗组大鼠于缺血30min再灌注30min时，取近端空肠、末端回肠粘膜，并抽取门静脉血。用Western法检测小肠粘膜组织中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达，用ELISA法检测血清中D-乳酸浓度。于再灌注开始时结扎10cm末端回肠，灌注0.5ml20mg/ml FD4溶液，30min后取门静脉血，用荧光分光光度计测血清中荧光强度。Western条带用Quantity One4.4软件分析。各检测指标以均数±标准差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，各组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有显著统计学意义。　　 结果：与对照组相比，I/R组大鼠紧密连接蛋白表达显著减少，FD4浓度和D-乳酸水平明显升高(P<0.05)。与I/R组比较，各EGF治疗组的FD4水平均显著下降；D-乳酸只在Pre-L组明显降低；紧密连接蛋白的表达在Pre-L、Pre-S和Post-L组都有明显恢复，而在Post-S组无明显改善。　　 结论：在缺血性损伤后早期，EGF对大鼠小肠肠粘膜屏障功能损伤具有防护作用。　　 研究2.4 外源性rh-EGF对I/R损伤后早期炎症反应的影响　　 目的：观察特定I/R损伤时，不同剂量、不同时机应用外源性EGF对炎症反应的影响。　　 方法：实验大鼠分组同研究2.1。模型组和治疗组大鼠于缺血30min再灌注30min时，取门静脉血，检测血清中炎症因子IL-6和TNF-α的活性和含量。数据以均数±标准差表示，采用SPSS18.0统计软件进行分析，各组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有显著统计学意义。　　 结果：缺血性损伤后，I/R组大鼠的IL-6和TNF-α浓度明显增高至304.23±31.11 pg/ml和88.40±22.86 pg/ml(P<0.05 vs.对照组)；四个治疗组的IL-6和TNF-α浓度都有明显降低(P<0.05 vs.I/R组)。　　 结论：在缺血性损伤后早期，EGF能够减轻肠道I/R损伤后的炎症反应。　　 第二部分小结：　　 大鼠小肠I/R损伤后，D-乳酸、FD4浓度、TNF-α和IL-6的水平明显升高，病理学改变明显，TJs表达显著减少，而隐窝细胞增殖水平无明显改变；给予外源性EGF处理后，小肠粘膜损伤程度、隐窝细胞增殖程度和TJs的表达在Pre-L、Pre-S和Post-L组都有明显改善，而在Post-S组没有明显改变；D-乳酸浓度只在Pre-L组显著降低；FD4浓度、TNF-α和IL-6在四个治疗组都有明显改善。EGF对大鼠小肠I/R损伤后肠粘膜屏障具有防护作用，而且这种作用具有一定的剂量-时机依赖性。