保加利亚乳杆菌是发酵乳制品发酵剂主体菌种之一,其高生物量是开发高效直投式发酵剂的关键。目前研究发现即使在营养充足条件下,发酵对数末期增殖能力仍会下降,这可能与菌体生理状态密切相关,因此挖掘保加利亚乳杆菌培养过程中菌体生理状态变化以及其对活性菌体数量的影响,揭示培养过程菌体分裂的影响机制,促进菌体分裂以解决菌体增殖瓶颈,提高菌体培养密度,对实现发酵剂高活性制备具有重要意义。本文通过探讨保加利亚乳杆菌sp1.1培养过程中菌体生理状态变化、获取菌体分裂与死亡状态信息并调控其分裂和增殖,为乳杆菌高密度培养工业化实施奠定基础。本研究采用荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）与平板计数相结合的方式,对比各方法定量菌体活性、可培养性及膜损伤的差异,分析保加利亚乳杆菌sp1.1培养过程中的主要生理状态。结果表明,qPCR检测菌体数量具有高效率及高准确性的特点,菌体的16S r RNA基因拷贝数与菌体数量在qPCR中呈线性关系（R2=0.9981）,检测限低至15.1 CFU/m L/反应,扩增效率高达98.42%,引入终浓度60μmol/L的叠氮溴化丙啶后,qPCR可以分辨和定量活性状态菌体,并与平板计数差异不显著（p>0.05）。利用该方法检测培养过程中菌体生理状态,结果发现,保加利亚乳杆菌sp1.1培养过程中自对数末期开始出现可培养（33.71%～54.63%）、活性不可培养（23.30%～39.72%）、细胞膜损伤（12.73%～30.59%）以及溶解等生理状态,其中可培养是对数末期和衰亡期的主要生理状态,菌体溶解死亡在此期间持续发生,但无法准确定量。采用荧光染料示踪方法对保加利亚乳杆菌sp1.1分裂和死亡速率进行检测,揭示培养过程中菌体分裂和死亡的动态定量变化规律。对荧光染料示踪方法进行优化,结果表明,10μmol/L的羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯在不影响菌体活性、增殖和酸化性能的前提下,检测的菌体分裂数与传统方法一致,分裂数的阈值高达6次。检测菌体分裂和死亡变化,结果表明,菌体分裂速率自对数末期开始快速下降,到衰亡期仅完成0.46次分裂,菌体死亡速率自稳定期开始超过分裂速率。应用前体队列模型分析发现,分裂速率的下降（回归系数0.2386）比死亡速率（回归系数0.0140）对活性菌体数量具有更大的影响。pH值降低是影响乳酸菌增殖的主要因素之一,为了探索pH影响保加利亚乳杆菌sp1.1菌体分裂的机制,分析了低pH下菌体分裂、营养代谢和细胞周期关键过程的变化。结果表明,菌体分裂在pH 4.1时被抑制,可培养菌数在pH低于4.1时开始下降,该pH是菌体分裂停止但可培养菌数仍然维持的临界pH。进一步分析临界pH（pH 4.1）条件下菌体代谢主要营养物质及胞内能量变化,发现菌体对葡萄糖的消耗率从pH 6.5时的22.6%减少至5.27%,蛋白消耗率接近于零,同时,胞内ATP显著减少（p<0.05）,H+-ATPase活性显著增强（p<0.05）,菌体能量供应受到影响。分析临界pH对菌体细胞周期过程影响,结果表明临界pH通过抑制细胞尺寸增大、干扰DNA复制、抑制分裂关键基因fts Z的表达等机制抑制菌体的分裂。分析细胞壁水解和合成酶变化,结果发现随着pH降低,肽聚糖水解酶活性增强、转录表达上调,肽聚糖合成酶的表达下调,细胞壁合成酶和水解酶失衡,引起菌体损伤和溶解。基于以上研究,采用外源添加氨基酸调节临界pH（pH 4.1）下菌体的分裂,利用离子交换树脂吸附乳酸调节培养基pH,以促进保加利亚乳杆菌sp1.1的增殖。结果表明,添加50 mmol/L组氨酸后,临界pH下菌体最大分裂数增加至2.36,接近pH 6.5下的菌体分裂数（3.61）,菌体细胞面积和菌体长度分别增大至临界pH下未添加组氨酸时的1.38～1.92倍和1.28～1.73倍,细胞周期关键基因dna A和fts Z的表达分别上调至最高3.76倍和7.04倍。采用离子交换树脂调节培养基pH至5.5～5.8,使分批培养中可培养菌数达到未添加树脂时的1.75倍,使补料分批培养中可培养菌数达到未添加树脂时的10倍,补料分批培养中的可培养菌体数量在24 h内达到7.83×109 CFU/m L,实现了乳酸菌的高密度培养。根据上述结果,可以得到如下结论,本研究通过qPCR、PMA-qPCR与平板计数联合的方法发现保加利亚乳杆菌sp1.1培养过程中存在4种生理状态,进一步分析发现分裂速率对活性菌数的影响大于死亡速率,揭示了乳酸导致的低pH通过干扰菌体代谢和下调细胞周期关键基因的表达的机制抑制菌体分裂,最后通过外源补充氨基酸促进了菌体分裂,使用离子交换树脂调节pH实现了菌体高密度培养,为高活性保加利亚乳杆菌发酵剂的生产提供研究基础。