极端嗜热古菌—硫矿硫化叶菌拓扑异构酶Ⅲ单链DNA切割与再连接反应的研究

来源 :中国科学院微生物研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yulequ
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极端嗜热古菌-硫矿硫化叶菌属于古菌域泉古菌界,最适生长温度为70-85℃,最适生长pH约为3。本论文对硫矿硫化叶菌拓扑异构酶III(Sso topo III)催化的DNA负超螺旋松弛反应的步骤进行了研究,获得了以下主要结果。(1)Ssotopo III对单链DNA的亲和力比对双链DNA的亲和力高两个数量级以上;另外,Sso topo III在较低温度下(25℃)结合单链DNA的能力要比在高温下(65℃)高出数十倍。(2)Sso topo III能够促进DNA退火,其效率在蛋白浓度达到65 nM时最高,而在更高浓度下效率下降。(3)Sso topo III在75℃具有最强的松弛DNA负超螺旋的活性,但是,Sso topo III的单链DNA切割活性和再连接活性的最适温度不同:切割活性的最适温度为25—50℃,但高效再连接只发生在较高的温度(例如45℃);单链DNA的切割反应与再连接反应之间存在着受温度影响的平衡。DNA再连接的温度依赖性可能是Sso topo III在低温(25℃)下不能松弛DNA负超螺旋的原因。(4)在切割反应中,加入非切割互补链、使其与切割链退火,能够改变单链DNA切割与再连接反应的平衡,从而大大促进切割链的再连接。(5)非切割链与切割链上从切割位点上游4个碱基至下游2个碱基的区域的退火对于其促进再连接反应的能力至关重要。但是,非切割链促进再连接的作用能够容忍碱基错配。甚至当非切割链的切割位点附近有多个非配对碱基时,退火介导的再连接反应依然能有效发生。(6)采用分别含切割链序列和互补链序列的两个单链共价闭合DNA小环进行退火介导的再连接反应时,两个小环形成链环,提示在此过程中发生了非切割链的穿越。(7)UV交联实验提示,在从单链模板结合到切割这一过程中,Sso topo III可能在单链底物上移动。   本研究的结果提示,Sso topo III可能通过促进同源和异源DNA双链之间的退火,帮助维持基因组的稳定性。
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