糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常见和严重的并发症之一,不积极治疗的DN最终进展为终末期肾衰竭(ESRD),在西方国家,DN是ESRD原发疾病之首。以往认为,糖尿病和高血压所致的肾小球高灌注和过度滤过以及高血糖所致的蛋白非酶糖化和糖化终末产物(AGEs)生成在糖尿病肾病发病中起主要作用。现在越来越多的证据显示,炎症在糖尿病及其并发症的发病中起重要作用。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是近年发现并倍受关注的一种信号转导型模式识别受体(pattern-recognition receotors,PRR),通过识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular parrems,PAMPs)来激活固有免疫系统,还可以诱导T细胞分化,帮助机体建立获得性免疫。TLRs可识别外源性或内源性配体,激活信号通路并导致下游炎症因子的表达增加。肾小球的系膜细胞和肾小管上皮细胞都有TLRs的表达。TLR2和TLR4组成性表达于近端小管和远端小管上皮细胞,在肾缺血/再灌注模型小鼠肾脏,TLR2和TLR4 mRNA表达及蛋白的合成明显增多。不少研究揭示了TLRs在肾脏缺血损伤及炎症反应中的作用,但是对TLRs在糖尿病肾病中的作用还未见报告。本研究利用实验性糖尿病模型来探讨:①在糖尿病大鼠肾脏中Toll样受体信号通路是否激活;②葡萄糖对大鼠肾小管上皮细胞Toll样受体表达的影响；③刺激Toll样受体信号通路对实验性糖尿病小鼠蛋白尿、肾功能、肾脏病理损害以及肾脏炎症细胞浸润的影响。　　 第一部分 TLR2、TLR4在糖尿病大鼠肾脏中的表达　　 一.材料和方法：　　 1.糖尿病大鼠模型的建立　　 健康雄性SD大鼠,200～250g,共32只。随机分为对照组和糖尿病模型组两组。正常对照组(NC组)6只,糖尿病模型组(DM组)18只。实验前测定体重,血糖。DM组大鼠禁食不禁水12小时后,予一次性尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)(以0.1 M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制)50mg/kg。48小时后尾静脉采血,快速血糖仪测随机血糖,一周后复测空腹血糖,以两次随机血糖>16.7mmol/l和空腹血糖>13.9mmol/l为糖尿病模型建立成功。对照组予等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液注射。将DM组分成3个亚组,在实验过程中于不同时间点(2周、4周、8周)留取血、尿、组织标本。用RBP-1B型大鼠血压计采用鼠尾尾套加压阻断法测量大鼠血压。　　 2.组织学常规检查　　 肾组织石蜡切片行PAS和HE染色,观察肾组织肾小球硬化程度和肾小管损害程度。肾小球系膜区增宽程度按0-3分的半定量计分方法评价:0级为无系膜增宽,计0分；1级为轻度系膜增宽,计1分；2级为中度系膜增宽,计2分；3级为重度系膜增宽,计3分。每个动物至少评价30个肾小球,最终评分由所评价的动物所有肾小球计分的平均值得出,结果表示为均数±标准误,评分采用盲法。　　 3.免疫组织化学染色和量化　　 肾组织石蜡切片分别用抗TLR2抗体(Santa Cruz,USA),小鼠抗-大鼠CD68抗体(识别大鼠巨噬细胞)(Serotec公司,UK)行免疫组织化学染色。免疫组化染色结束后,切片再套染无苏木素的PAS,逆梯度酒精脱水,二甲苯透明后中性树脂封片。所有标本均进行双份染色,为防止假阴性,每份标本旁均放置脾脏作为阳性对照。同时以1×PBS代替一抗作为阴性对照。分别计算20个连续非重叠的肾皮质区高倍镜视野下(×400)CD68+巨噬细胞数,除以高倍视野数,得每皮质高倍视野下的平均细胞数。数据以均数±标准误表示。　　 4.RT-PCR　　 提取肾组织总RNA,RT-PCR检测TLR2、TLR4、MyD88和MCP—1 mRNA,以GAPDH为内参照,计算与内参照比值。　　 5.Western Blot　　 提取肾组织蛋白,Western Blot检测TLR2、TLR4、MyD88、HSP70、HMGB1,以β-actin为内参照,计算与内参照比值。提取肾组织核蛋白,WesternBlot检测NF-κB p65,以Fibrillarin为内参照,计算与内参照比值。　　 6.统计学分析　　 均数比较采用方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。　　 二.结果：　　 1.各组大鼠血糖、体重和尿量的测定　　 NC组大鼠随着时间的延长,体重逐渐增加,各时间点体重有显著差异。DM组随着时间的延长体重无明显增加。NC组和DM组2、4、8周体重分别是[2w,(240±13)g vs(204±14)g,P<0.01；4w,(268±12)g vs(197±15)g,P<0.01；8w,(303±13)g vs(210±8)g,P<0.011。DM组大鼠各时间点血糖较NC对照组明显增高,统计学上有显著差异。NC组和DM组2、4、8周血糖值分别是[2w,(4.7±0.7)mmol/l vs(23.3±0.3)mmol/l,P<0.01；4w,(4.8±0.6)mmol/l vs(24.9±0.7)mmol/l,P<0.01；8w,(4.4±0.4)mmol/l vs(23.5±0.8)mmol/l,P<0.01]。DM组大鼠各时间点尿量显著多于NC对照组,统计学上有显著差异。NC组和DM组2、4、8周24小时尿量分别是[2w,(17±4)ml vs(168±23)ml,P<0.01；4w,(13±4)ml vs(190±28)ml,P<0.01;8w,06±3)ml vs(181±30)ml,P<0.01]。　　 2.各组大鼠肾重/体重变化　　 DM组各时间点与NC组比较,肾重/体重有显著增加(P<0.01)。在NC组8周时,肾重/体重为(6.36±0.47)g/kg,DM组2、4、8周肾重/体重分别为(11.8±1.3)g/kg、02.6±1.2)g/kg、(11.9±1.0)g/kg。　　 3.24小时尿蛋白排泄量　　 DM组随着时间的延长,24小时尿白蛋白的排泄量逐渐升高,各时间点统计学上有显著差异。与NC组比较,DM组各时间24小时尿白蛋白的排泄量明显升高,统计学上有显著差异。NC组和DM组2、4、8周24小时尿白蛋白的排泄量分别是[2w,(122.9±13.3)μg/24h vs(450.8±37.3)μg/24h,P<0.01;4w,(130.1±15.0)μg/24h vs(1390.5±111.2)μg/24h,P<0.01；8w,(125.1±18.1)μg/24h vs(3197.8±214.5)μg/24h,P<0.01]。　　 4.各组大鼠血压的变化　　 在DM组2周、4周时大鼠尾动脉收缩压与NC组各时间点相比略有升高趋势,但统计学上无显著差异。在DM组8周时,收缩压较NC组升高,统计学上有显著差异。NC组和DM组2、4、8周尾动脉收缩压分别是[2w,(109±8)mmHgvs(115±4)mmHg,P>0.05；4w,(114±6)mmHg vs(120±5)mmHg,P>0.05；8w,(113±6)mmHg vs(143±3)mmHg,P<0.01]。　　 5.血生化　　 在DM组,8周时血清肌酐水平明显上升,与NC组以及DM2、4周组比较,在统计学上均有显著差异(P<0.01)。NC组8周时血清肌酐为(36.5±6.5)μmol/l,DM组各时间点血清肌酐为[2w,(42.8±6.3)μmol/l:4w,(44.6±7.9)μmol/l；8w,(73.8±6.8)μmol/1]。DM组血尿素氮在2、4、8周各时间点均较NC组升高,有统计学差异(P<0.05)。NC组血尿素氮为(7.1±0.7)mmol/l,DM组血尿素氮为[2w,(9.1±1.6)mmol/l；4w,(13.9±2.7)mmol/l；8w,(17.1±2.7)mmol/1]。DM组血胆固醇和甘油三酯均较NC组升高,有统计学差异(P<0.01)。NC组血胆固醇、甘油三酯水平分别为(1.38±0.18)mmol/l、(1.15±0.42)mmol/l。DM组血胆固醇为[2w,(2.08±0.39)mmol/l;4w,(2.16±0.42)mmol/l；8w,(2.18±0.17)mmol/l],血甘油三酯为[2w,(3.05±1.05)mmol/l；4w,(4.40±0.87)mmol/l;8w,(4.15±1.55)mmol/l]。　　 6.光镜病理学变化　　 在DM组大鼠可以看到:肾小球体积增大,肾小球囊腔缩小,系膜区增宽,基底膜增厚以及肾小管肥大。而NC组无以上变化。DM组肾小球系膜增宽半定量评分2、4、8周分别为(0.98±0.28)、(1.84±0.30)和(2.09±0.11),显著高于NC组(0.02±0.02)(P<0.01)。　　 7.肾脏炎症细胞浸润　　 免疫组化染色显示在NC组大鼠肾间质偶尔见到个别巨噬细胞和T细胞浸润。而在糖尿病大鼠模型中,STZ注射后2周,肾间质内有个别巨噬细胞浸润,而巨噬细胞在肾间质的浸润随着病程进展逐渐增多,在8周时达到高峰。糖尿病模型组2周、4周和8周肾间质巨噬细胞浸润数分别为(2.7±1.4)个/HPF、(8.1±3.2)个/HPF和(14.1±4.0)个/HPF,4周和8周组显著高于NC组(1.7±0.9)个/HPF,P值均小于0.01。在肾小球内仅检测到少量巨噬细胞浸润。　　 8.肾脏TLR2的表达　　 免疫组化染色显示在正常肾小管上皮细胞有TLR2表达。DM组肾脏TLR2表达显著增多。　　 9.肾脏TLR2及TLR4蛋白的表达　　 以Western blotting方法检测大鼠肾脏组织中TLR2及TLR4蛋白的表达。在NC组,大鼠肾脏中有少量TLR2及TLR4的表达。在DM组,2周时即有TLR2及TLR4的表达的增高,并随着病程逐渐增加。DM组2周、4周和8周肾脏TLR2/β-actin的表达分别为(0.712±0.093)、(0.796±0.099)和(0.915±0.095),显著高于NC组(0.333±0.054)。P值均小于0.01。DM组2周、4周和8周肾脏TLR4/β-actin的表达分别为(0.692±0.076)、(0.828±0.103)和(0.963±0.124),显著高于NC组(0.300±0.071)。P值均小于0.01。　　 10.肾脏TLR2及TLR4 mRNA的表达　　 在NC组大鼠肾脏组织中可检测到少量TLR2及TLR4 mRNA。在DM组,2周时可检测到TLR2及TLR4的mRNA表达明显增高,并随着病程逐渐增加。DM组2周、4周和8周肾脏TLR2/GAPDH mRNA的表达分别为(0.7861±0.0787)、(0.9025±0.1010)和(0.9643±0.1027),显著高于NC对照组(0.3077±0.0832)。P值均小于0.01。DM组2周、4周和8周肾脏TLR4/GAPDH mRNA的表达分别为(0.6021±0.0683)、(0.6960±0.0893)和(0.8496±0.0771),显著高于NC对照组(0.2447±0.0424)。P值均小于0.01。　　 11.MyD88蛋白及mRNA的表达　　 在NC组大鼠肾脏可检测到少量MyD88蛋白及mRNA的表达。而在DM组,MyD88蛋白及mRNA的表达明显增高。DM组2周、4周和8周肾脏MyDS8/β-actin的表达分别为(0.534±0.060)、(0.715±0.092)和(0.951±0.105),显著高于NC组(0.270±0.034)。P值均小于0.01。DM组2周、4周和8周肾脏MyD88/GAPDHmRNA的表达分别为(0.8915±0.1305)、(1.0596±0.1210)和(1.1115±0.0794),显著高于NC组(0.3936±0.0672)。P值均小于0.01。　　 12.肾组织核蛋白NF-κB p65的表达　　 通过检测大鼠肾脏细胞核内NF-κB p65的表达,发现NC组细胞核内仅有少量NF-κB p65表达,而DM组细胞核内NF-κB p65表达明显增加。DM组2周、4周和8周肾脏NF-κB p65/Fibrillarin的表达分别为(0.436±0.049)、(0.675±0.067)和(0.768±0.077),显著高于NC组(0.208±0.030)。P值均小于0.01。　　 13.肾脏单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达　　 在NC组大鼠肾脏组织中可检测到少量MCP-1 mRNA。在DM组,2周时也可检测到MCP-1 mRNA表达较NC组增高,并随着病程逐渐增加。DM组2周、4周和8周肾脏TLR4/GAPDH mRNA的表达分别为(0.6415±0.0926)、(0.8743±0.0931)和(1.0604±0.1461),显著高于NC组(0.3790±0.0616)。P值均小于0.01。　　 14.TLR2及TLR4内源性配体的表达　　 我们还检测了大鼠肾脏TLR2、TLR4内源性配体HSP70(Heat shock protein70)和HMGBi(High-mobility group box1)的表达。在NC组大鼠肾脏可检测到少量HSP70和HMGB1的表达。DM组2周、4周和8周肾脏HSP70/β-actin的表达分别为(0.399±0.078)、(0.468±0.067)和(0.587±0.092),显著高于NC组(0.179±0.022)。P值均小于0.01。DM组2周、4周和8周肾脏HMGB1/β-actin的表达分别为(0.418±0.045)、(0.447±0.060)和(0.627±0.089),显著高于NC组(0.219±0.067)。P值均小于0.01。　　 15.糖尿病大鼠肾脏TLR2及TLR4表达水平与炎症细胞浸润的相关分析　　 将糖尿病大鼠肾脏浸润的CD68+巨噬细胞数与TLR2及TLR4蛋白表达量进行双变量相关分析后发现,TLR2及TLR4表达水平与浸润炎症细胞数成正相关。DM组TLR2与CD68+巨噬细胞数相关分析结果为r=0.667,P=0.003。TLR4与CD68+巨噬细胞数相关分析结果为r=0.648,P=0.004。相关系数为r,P<0.05表示有显著相关。　　 三.小结：　　 1.糖尿病大鼠模型表现为多饮、多尿、体重减轻和持续高血糖状态,并伴有尿白蛋白排泄率升高。　　 2.在糖尿病大鼠肾脏中,TLR2和TLR4无论是基因水平还是受体蛋白表达均有升高。　　 3.在糖尿病大鼠肾脏中,TLR2和TLR4表达增加伴随着MyD88表达增加、NF-κB的激活和MCP-1表达增加。　　 4.在糖尿病大鼠肾脏中,TLR2和TLR4表达上调与巨噬细胞积聚呈正相关。　　 第二部分不同浓度葡萄糖对肾小管上皮细胞TLR2表达的影响　　 一.材料和方法：　　 1.实验细胞培养及分组　　 大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液传代培养。用于RT-PCR.检测的细胞以1×106/ml接种于100ml培养瓶。根据培养液分为四组:①低糖组,加10％FBS-DMEM培养液(D-葡萄糖,5.Smmol/L)；②甘露醇对照组,DMEM培养液(D-葡萄糖,5.Smmol/L)+甘露醇(19.Smmol/L),；③高糖Ⅰ组(D-葡萄糖,15mmol/L)；④高糖Ⅱ组(D-葡萄糖,25mmol/L)。NRK52E细胞接种于100ml培养瓶中,37℃、5％CO2培养,生长到约70％～80％融合时,弃旧培养基,加入无血清培养基24小时使同步化。PBS洗2次,按上述分成4个组,每组2个平行细胞瓶,继续培养24小时,终止培养。　　 2.Western Blot　　 取干预好的细胞,提取细胞蛋白,Western Blot检测TLR2,以β—actin为内参照,计算与内参照比值。　　 3.细胞总RNA提取　　 取干预好的细胞,倒净培养液,提取总RNA；紫外分光光度计测得A260/280>1.8,置-80℃保存。　　 4.RT-PCR　　 RT-PCR检测TLR2 mRNA和MCP-1 mRNA,以GAPDH为内参照,计算与内参照比值。　　 5.统计学分析　　 均数间比较采用方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。　　 二.结果：　　 1.细胞形态　　 经相差显微镜观察,正常培养的NRK52E细胞呈卵圆形,中央有一卵圆形细胞核,胞浆饱满,折光性强,具有上皮样细胞生长特点。细胞生长逐渐相互融合铺满瓶底后呈铺路石样外观。经高糖处理后的NRK52E细胞形态更为饱满,细胞生长逐渐相互融合亦呈铺路石样外观。　　 2.葡萄糖对NRK52E细胞TLR2蛋白表达的影响　　 在低糖组和甘露醇对照组,NRK52E细胞有少量TLR2蛋白的表达。在高糖Ⅰ组和高糖Ⅱ组,TLR2/β-actin的表达分别为(0.550±0.066)和(0.658±0.051),较低糖组(0.202±0.013)明显增N(P<0.02)。高糖Ⅱ组TLR2表达量较高糖Ⅰ组增加(P<0.05)。低糖组和甘露醇组TLR2表达无统计学差异[(0.202±0.023)vs(0.193±0.016),P>0.05]。　　 3.葡萄糖对NRK52E细胞TLR2 mRNA表达的影响　　 在低糖组和甘露醇对照组,NRK52E细胞有少量TLR2 mRNA表达。在高糖Ⅰ组和高糖Ⅱ组,TLR2/GAPDH mRNA的表达分别为(0.3375±0.0308)和(0.4973±0.0496),较低糖组(0.2293±0.0278)明显增加(P<0.01)。高糖Ⅱ组TLR2mRNA表达较高糖Ⅰ组增加(P<0.01)。低糖组和甘露醇组TLR2 mRNA表达无统计学差异[(0.2293±0.0278)vs(0.2380±0.0425),P>0.05]。　　 4.葡萄糖对NRK52E细胞MCP-1 mRNA表达的影响　　 在低糖培养组和甘露醇对照组,NRK52E细胞有少量MCP-1 mRNA表达。在高糖Ⅰ组和高糖Ⅱ组,MCP-1/GAPDH mRNA的表达分别为(0.3500±0.0371)和(0.4563±0.0506),较低糖组(0.2450±0.0364)明显增加(P<0.01)。高糖Ⅱ组MCP—1mRNA表达较高糖Ⅰ组增加(P<0.05)。低糖组和甘露醇组MCP-1 mRNA表达无统计学差异[(0.2450±0.0364)vs(0.2230±0.0242),P>0.05]。　　 三.小结：　　 1.肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)表达TLR2,高浓度葡萄糖可增加肾小管上皮细胞TLR2的表达。　　 2.高浓度葡萄糖刺激肾小管上皮细胞表达MCP-1mRNA显著上调。　　 第三部分刺激TLR2通路对糖尿病小鼠肾损害的影响　　 一.材料和方法：　　 1.实验性糖尿病小鼠模型的建立　　 健康雄性C57小鼠,20～25g,共18只。随机分为对照组和糖尿病模型组两组。正常对照组(NC组)6只,糖尿病模型组12只。糖尿病组小鼠禁食不禁水6小时后,予腹腔注射链脲佐菌素(以0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制)50mg/kg,连续5天。一周后尾静脉采血,快速血糖仪测随机血糖,以两次随机血糖>15mmol/l为糖尿病模型建立成功。将糖尿病小鼠随机分成2个亚组,糖尿病对照组(DM组)和Pam3CysSK4+DM组(干预组)。Pam3CysSK4是一种合成的细菌脂肽,为TLR2的特异性激动剂。DM组予等量溶媒(0.1％DMSO)腹腔注射。干预组予100μg Pam3CysSK4每周注射一次,连续四周。正常对照组予等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。　　 2.组织学常规检查　　 肾组织石蜡切片行PAS和HE染色,方法同第一部分。组织学评分方法同第一部分。　　 3.免疫组织化学染色和量化　　 肾组织冰冻切片用大鼠抗-小鼠F4/80抗体(识别小鼠巨噬细胞)(Serotec公司,UK)行免疫组织化学染色。免疫组化染色结束后,切片套染苏木素,再逆梯度酒精脱水,二甲苯透明后中性树脂封片。所有标本均进行双份染色,为防止假阴性,每份标本旁均放置脾脏作为阳性对照。同时以1×PBS代替一抗作为阴性对照。计数方法同第一部分。　　 4.RT-PCR　　 提取肾组织总RNA,RT-PCR检测MyD88和MCP-1 mRNA,以GAPDH为内参照,计算与内参照比值。　　 5.Western Blot　　 提取肾组织核蛋白,Western Blot检测NF-κB p65,以Fibrillarin为内参照,计算与内参照比值。　　 6.统计学分析　　 均数比较采用方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。　　 二.结果：　　 1.各组小鼠血糖和体重的测定　　 NC组小鼠随着时间的延长,体重逐渐增加。DM组体重增加不明显。干预组体重逐渐减轻,较同时间点NC组比较明显减轻(P<0.01)。在4周时,干预组较DM组体重减轻(P<0.01)。NC组、DM组、干预组2周时体重分别是(25.0±1.6)g、(22.3±1.9)g、(21.6±1.2)g,4周时体重分别是(27.9±1.4)g、(23.2±1.6)g、(19.1±1.3)g。　　 DM组及干预组血糖较NC组明显增高,统计学上有显著差异(P<0.01)。干预组血糖较DM组也有明显升高(P<0.05)。NC组、DM组、干预组2周血糖分别是(5.7±0.6)mmol/l、(24.0±1.6)mmol/l、(26.3±1.3)mmol/l,4周血糖分别是(5.8±0.7)mmol/l、(26.7±1.2)mmol/l、(28.9±1.2)mmol/l。　　 2.各组小鼠肾重/体重变化　　 DM组及干预组与NC组比较,肾重/体重有增加(P<0.01)。干预组与DM组比较无显著差异(P>0.05)。NC组、DM组、干预组肾重/体重分别为(5.92±0.81)g/kg,(9.62±1.46)g/kg,(10.86±1.24)g/kg。　　 3.24小时尿蛋白定量　　 与NC组比较,4周时DM组和干预组24小时尿白蛋白排泄量明显升高,统计学上有显著差异(P<0.01)。与DM组比较,干预组24小时尿白蛋白的排泄量显著升高(P<0.01)。NC组、DM组、干预组尿白蛋白的排泄量分别为(49.4±9.2)μg/24h,(401.2±42.3)μg/24h,(516.7±52.2)μg/24h。　　 4.血生化　　 DM组血尿素氮水平较NC组升高[DM组,(9.59±0.73)mmol/l vs NC组,(7.82±1.18)mmol/l,P<0.01]。DM组血清总蛋白水平较NC组下降[DM组,(50.57±1.72)g/l vs NC组,(54.62±2.97)g/l,P<0.05]。DM组血胆固醇水平较NC组有明显升高[DM组,(2.94±0.45)mmol/l vs NC组,(2.05±0.39)mmol/l,P<0.011。　　 干预组血清肌酐较DM组有显著升高[干预组,(41.51±2.89)μmol/l vs DM组,(36.46±3.35)μmol/l,P<0.05]。干预组血尿素氮水平较DM组升高[干预组,(13.60±1.45)mmol/l vs DM组,(9.59±0.73)mmol/l,P<0.01]。干预组血白蛋白水平较DM组下降[干预组,(27.03±3.83)g/l vs DM组,(31.47±1.72)g/l,P<0.05]。　　 5.光镜病理学变化　　 在DM组,可以看到:肾小球体积增大,肾小球囊腔缩小,系膜区增宽,基底膜增厚,肾小管肥大。而NC组无以上变化。在干预组,上述变化更为显著。DM组肾小球系膜区增宽半定量评分高于NC组[DM组,(1.15±0.18)vs NC组,(0.01±0.02),P<0.01]。干预组肾小球系膜区增宽半定量评分高于DM组[干预组,(1.47±0.21)vs DM组,(1.15±0.18),P<0.05]。　　 6.肾脏炎症细胞浸润　　 免疫组化染色显示在NC对照组小鼠肾间质偶尔见到个别巨噬细胞。而在糖尿病小鼠模型中,STZ注射后4周肾间质内有巨噬细胞浸润,干预组浸润细胞显著多于DM组(P<0.01)。NC组、DM组和干预组肾间质巨噬细胞浸润数分别为(1.2±0.6)个/HPF、(10.9±4.0)个/HPF和(18.1±3.7)个/HPF。在肾小球内仅检测到少量巨噬细胞浸润。　　 7.MyD88 mRNA的表达　　 在NC组小鼠肾脏,仅检测到微量MyD88 mRNA的表达。在DM组和干预组MyD88 mRNA的表达较NC组显著增高,而干预组DM组有显著升高(P<0.01)。NC组、DM组、干预组MyD88/β-actin mRNA的表达分别为(0.3879±0.0742)、(0.7115±0.0974)和(0.9218±0.1181)。　　 8.肾组织核蛋白NF-κB p65的表达　　 通过检测小鼠肾脏组织细胞核内NF-κB p65蛋白的表达,我们可看到在NC组细胞核内NF-κB p65表达水平很低,而DM组和干预组细胞核内NF-κB p65表达明显增加,干预组较DM组增加(P<0.01)。NC组、DM组、干预组NF-κBp65/Fibrillarin的表达分别为(0.250±0.061)、(0.449±0.064)和(0.624±0.085)。　　 9.肾脏单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达　　 在NC组小鼠肾脏组织中可检测到少量MCP-1 mRNA。在DM组,检测到MCP-1mRNA表达较NC组增高(P<0.01)。干预组较DM组进一步升高(P<0.01)。NC组、DM组、干预组MyD88/β-actin mRNA的表达分别为(0.2969±0.0707)、(0.6103±0.1005)和(0.8216±0.0815)。　　 三.小结：　　 1.应用TLR2激动剂Pam3CysSK4刺激Toll样受体信号通路进一步加重糖尿病小鼠蛋白尿。　　 2.刺激Toll样受体信号通路加重糖尿病小鼠肾小球硬化、肾小管损伤、炎症细胞浸润和肾功能损害。　　 3.刺激Toll样受体信号通路增加糖尿病小鼠肾脏NF-κB活化和MCP-1mRNA的表达。　　 结论：　　 本研究证明TLR2和TLR4在糖尿病大鼠肾脏中表达增加,并与炎症细胞浸润的相关。体外实验证实葡萄糖本身可增加肾小管上皮细胞TLR2的表达。刺激该信号通路能增加糖尿病小鼠尿蛋白的排泄、加重肾脏组织学损害并增加趋化因子MCP-1的表达,伴随肾脏炎症细胞浸润增加。本研究表明了Toll样信号通路在糖尿病肾损害中发挥重要的作用。