第一部分：分泌抗死亡受体-5单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定 目的：分泌抗死亡受体-5单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立、及其单克隆抗体的制备、纯化与鉴定。 方法：①以纯化的DR5分次免疫BALB/C小鼠，分离小鼠脾细胞，进行细胞融合；②采用ELISA法初筛抗DR5阳性孔，并对阳性孔进行克隆。以Jurkat细胞做为靶细胞，采用FITC标记的抗小鼠IgG流式细胞术(FCM)检测阳性克隆孔杂交瘤细胞培养上清；③采用有限稀释法克隆杂交瘤细胞3次，获取单细胞杂交瘤；MTT方法特异性筛选有诱导细胞凋亡活性的杂交瘤细胞，通过FITC-AnnexinV/PI双色标法FCM检测Jurkat细胞凋亡率；④采用小鼠单克隆抗体型别鉴定试剂盒ELISA测定mAb的类型及亚型；⑤荧光标记二抗，FCM测定单抗结合DR5特异性；⑥ELISA检测mAb的抗原表位及亲和常数；⑦将抗DR5单克隆抗体细胞株注射至小鼠腹腔，获得大量富含单抗的腹水，通过亲和层析技术可得到大量纯化的抗DR5的单抗。 结果：①通过细胞融合杂交瘤技术获得3株可稳定分泌抗DR5mAb的杂交瘤细胞株：命名为YM366EC、YM366ED、mDRA-6。其中1株mAbmDRA-6具有TRAIL活性，可诱导Jurkat细胞凋亡；②sDR5对mAb同DR5结合的阻断实验结果表明mAbYM366ED和mAbYM366ED与DR5可特异性结合；③3株杂交瘤细胞所有产生的抗DR5mAb均能与sDR5结合；④阻断实验结果表明sDR5能够完全阻断抗DR5mAb与Jurkat细胞膜的结合，表明抗DR5-mAb与细胞膜DR5的结合是特异性的；⑤FITC-AnnexinV/PI双染法流式细胞仪测检及电泳结果表明，在0.5μg/ml浓度作用4h，mDRA-6诱导87.84％细胞凋亡；⑥经鉴定三株杂交瘤细胞分泌的抗体亚型为IgG1；抗原表位类型为构象表位；mAbYM366EC、YM366ED和mDRA-6可识别DR5不同的抗原表位；其特异性识别人DR5，与人Fas、DR4等无免疫交叉反应；⑦用降至烷与福氏不完全佐剂预处理小鼠比液体石蜡效果好，前者腹水产生快而且量也多；雌鼠与雄鼠之间腹水的产量无明显差异；⑧以非竞争酶免疫法测定的mAb的亲和常数，结果表明mAbYM366EC和YM366ED与DR5结合的亲和常数，分别为2.63×109L/mol和1.00×109L/mol；⑨经硫酸铵沉淀和蛋白G亲合层析制备抗体，SDS-PAGE显示轻链和重链两条带，表观分子量分别为27kD和48kD，相对分子量为150kD，纯度为100％。 结论：获得3株可分泌抗DR5mAb的杂交瘤细胞株，其中一株可分泌具有诱导细胞凋亡活性抗体的杂交瘤细胞；另外两株杂交瘤细胞系YM366EC、YM366ED分泌的抗体无诱导凋亡活性，可识别2种不同的抗原表位。为进一步研究其生物学活性与检测方法的建立奠定了良好的基础。 第二部分：定量测定DR5双抗体夹心ELISA方法的建立 目的：建立敏感性、特异性和重复性好的定量检测DR5的双抗体夹心ELISA方法，并探讨紫外线照射微孔板、洗涤液和抗体稀释液、封闭液的种类等对实验结果的影响，为临床应用奠定基础。 方法：①采用proteinG层析法纯化获得两株识别不同表位的抗DR5单克隆抗体；②其中一株IgG标记HRP；③另一株包被反应板，加待测定血清和DR5阳性及阴性对照，加标记的IgG抗体，经显色后测定A值。从标准DR5曲线上定量样品中DR5量。其特异性达98％以上，灵敏度达0.01ug/L；④利用研制的诊断试剂盒用于临床病人体液中DR5的含量测定。初步检测了50份临床标本。 结果：①反应板经紫外线照射后，检测DR5的OD值均高于未照射组，提示紫外照射处理微孔板可提高检测的灵敏度；②不同洗涤液和酶标抗体稀释液对实验结果影响结果表明Tris液比PBS检测DR5的OD值高0.1～0.3，而且本底比PBS低0.05；③封闭液的实验结果显示10％的胎牛血清封闭效果最好；④所建立的标准双抗体夹心ELISA法检测DR5的变异系数均小于5％，说明实验的重复性好，回收率均在85％以上，实验的准确性较高；⑤采用上述建立的检测DR5的方法检测30例正常人血清sDR5水平在10pg/ml以下。慢性乙型肝炎患者血清DR5水平均有不同程度的升高。 结论：首次建立了检测DR5的双抗体夹心ELISA法，可直接用于检测体液中DR5的含量，探讨DR5的表达与肿瘤病人预后及某些病毒感染之间的关系。为sDR5的基础和临床应用研究提供了有力的手段。