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目的：
传统的治疗手段目前难以从根本上修复急性心肌梗死(AMI)心脏的不可逆损害,AMI后心肌细胞丢失和心室重构,导致了心力衰竭的进展和临床死亡。近年来发现,骨髓间充质干细胞(MSCs)在一定条件下经体内体外诱导可以定向分化为心肌样细胞,有望成为治疗急性心肌梗死的新型种子细胞。本实验主要研究兔MSCs在体外分离、纯化、扩增后,以不同的移植方式,移植到经冠状动脉前降支结扎制备的急性心肌梗死兔体内,观察移植后心功能的变化及心脏病理改变的情况,为临床应用细胞移植治疗AMI提供有益的实验依据。
方法：
本课题实验设计包括三部分：第一部分,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离MSCs,在体外扩增培养,观察兔MSCs体外增殖能力；第二部分,采用冠状动脉结扎法制备兔AMI模型,术前、术后记录胸前导联心电图,观察心电图及局部心肌颜色的变化,术后4周行氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法明确梗死灶；第三部分,兔模型建立成功后即刻予粒细胞集落刺激因子(G-CSF)以10μg/kg·d皮下注射,同时模型建立成功3h后将体外纯化、扩增的MSCs,以静脉移植、主动脉根部移植及心外膜注射方式移植到兔体内,观察移植后AMI兔子心功能变化及心脏的病理改变。
结果：
第一部分,原代细胞培养中,可见细胞以分散、克隆集落方式增殖：第1～3d细胞大部分呈圆形、椭圆形生长；第3～7d贴壁细胞增多,并逐渐延展生长为多角形、星形或梭形；7～21d贴壁细胞明显增多,并有集落形成,相邻集落融合成片达80％以上,细胞排列呈漩涡状,细胞间界限不清,细胞呈长梭形；14～21d后,细胞传代,传代后的细胞不以集落方式生长,而是均匀分布长梭形细胞,杂质细胞明显减少,MSCs纯度升高。第3代细胞经流式细胞仪检测细胞表面抗原,CD29、CD44和CD105阳性,CD34阴性,符合MSCs的特点。第二部分,用冠状动脉结扎法制备急性心肌梗死模型,连接BL-410生物机能实验系统,术前、术后记录胸前导联心电图,开胸后,用眼科小圆针穿过心肌浅层,于左心耳下约5～10mm处双重缝扎左冠状动脉前降支,有ST段抬高,肉眼观心肌颜色由红变暗转苍白,提示AMI模型制备成功,6h后抽血测CTnI升高(12.8±1.3vs0.7±0.2,P＜0.05),进一步明确模型制备成功。TTC染色法证实有心肌梗死灶存在,HE染色可见梗死心肌呈空泡状。
第三部分,本课题以三组独立分组和一组空白实验对照组对移植方式进行比较研究。从实验结果和数据的统计处理结论来看,MSCs移植4周后,静脉移植组左室射血分数(EF)(41.00±2.00)和主动脉根部移植组EF(38.71±2.06),与对照组(37.40±2.70)比较,其心功能改善无明显统计学差异(P＞0.05),而心外膜移植组EF(45.50±1.64)较对照组有统计学差异(P＜0.05);血流动力学检测也提示与对照组相比,心外膜移植组左室收缩压(LVSP)(112.75±5.80,P<0.05)升高,左室舒张压(LVDP)(23.35±1.69,P<0.05)降低,心功能得以改善,而其余2组与对照组比较,无明显统计学意义；此外,心外膜移植组可以在梗死心肌周围找到5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记的阳性细胞,部分CD34染色阳性细胞参与形成新生血管,而其余2组梗死心肌组织周围未见明确的移植细胞。
结论：
第一部分,通过密度梯度离心法结合贴壁筛选培养法能在体外培养出高纯度的MSCs,可以作为组织工程的种子细胞。
第二部分,通过冠状动脉结扎法可以成功制备兔AMI模型,为实验动物学提供实验基础。
第三部分,只有经心外膜移植MSCs可改善AMI后心功能,而经静脉途径及主动脉根部移植MSCs对AMI后心功能的改善无明显统计学意义。