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背景
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，随着社会的发展和人们生活方式的改变，该病的发病率和死亡率逐年升高。肠道微生态是一个数量庞大、种类繁多、结构复杂的生态系统。肠道菌群失调时致病菌株及其代谢产物会影响肠黏膜上皮细胞和肠腔微环境，导致肠道疾病的发生。具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌及其代谢产物作用于肠道微生态，与结直肠癌的发病密切相关。目前尚缺乏无创、操作取材简便，特异性好、灵敏度高的检测指标用于对结直肠癌早期患者筛查。研究结直肠癌患者大便标本中致病菌株的种类与丰度与结、直肠癌发生发展的关系，评价其作为诊断标志物的潜能，具有十分重要的临床意义。
目的
分析具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌在我国东南沿海地区正常人群、结直肠癌癌前病变(结直肠腺瘤／息肉)人群以及结直肠癌人群中分布情况。分析致病菌株在结直肠的不同位置，肿瘤不同分期的分布情况。评价检测具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌的丰度是否可作为诊断结直肠癌的生物学指标。
方法
本研究收集2019-01至2019-12来汕头市中心医院就诊的、初次诊断的结直肠癌患者60例，初次诊断为结直肠腺瘤或息肉患者37例，以及正常体检者42例作为主要研究对象，收集研究对象基本资料，收集患者和正常对照的粪便样本及全血样本。通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测粪便样本中具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度。应用单因素方差分析统计分析致病菌株在不同研究组别的分布差异。利用ROC曲线评价具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度以及联合粪便潜血作为检测指标在结直肠癌以及结直肠癌癌前病变中的诊断效能。
结果
(1)本研究通过分析扩增曲线及PCR扩增参数Ct值(Cyclethreshold:扩增循环荧光域值)对扩增体系及反应条件进行优化，建立扩增效率高，结果准确的实验方法，为后续科学研究的准确奠定基础。
(2)本研究选取结直肠癌患者60例，癌前病变(腺瘤／息肉)患者37例以及正常对照人群42例。利用优化的qPCR方法对不同人群中具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌进行相对定量分析，结果显示具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌在正常人群的阳性检出率分别为19.05%、21.43%，在腺瘤／息肉患者中为59.46%、59.46%，在结直肠癌患者中为71.67%、68.33%。单因素方差分析结果显示具核梭杆菌的丰度在组间分布具有统计学差异(F=5.221,P=0.008)。Pks基因阳性的大肠杆菌的单因素方差分析结果显示其在三组间分布差异也具有统计学意义(F=6.267,P=0.003)。研究结果提示具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌可作为诊断结直肠癌的有潜力的生物标志物。
(3)进一步研究分析肿瘤位于结直肠的7个不同部位(包括乙状结肠、盲肠、直肠、直肠乙状结肠交界、升结肠、横结肠和降结肠)时，粪便中具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌丰度分布情况，结果显示在不同部位肿瘤组，其具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度的无统计学差异(具核梭杆菌：F=0.813,P=0.67；Pks基因阳性的大肠杆菌：F=2.602,P=0.144))，而在癌前病变组具核梭杆菌的丰度在组间具有统计学差异F=2.887,P=0.045；Pks基因阳性的大肠杆菌丰度分布无统计学差异。
(4)根据肿瘤分期标准(Tumor, Node, Metastasis, TNM)将肿瘤病人进行分组，分析具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌丰度在肿瘤不同分期间的分布差异。结果显示组间分布无统计学差异(具核梭杆菌：F=3.487,P=0.246；Pks基因阳性的大肠杆菌：F=0.912,P=0.617)。提示在肿瘤的不同阶段具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌都保持一定的富集，这为检测指标具有稳定性提供科学依据。
(5)本研究得出单独使用具核梭杆菌的丰度作为结直肠癌的诊断指标时，其特异度为73.9%，敏感度为69.2%，诊断效力ROC曲线下面积(Area Under Curve, AUC)=0.735，阳性预测值(Positive Predictive Value, PPV)=0.79，阴性预测值(Negative Predictive Value, NPV)=0.63;单独使用Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度作为结直肠癌检测指标，其特异度为73.3%，敏感度为93.3%，诊断效力AUC=0.810，PPV＝0.83，NPV＝0.89。而联合检测具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度以及粪便潜血对结直肠癌的诊断效力AUC=0.844，特异度为82.4%，敏感度为84.6%，PPV＝0.82，NPV＝0.85。进一步联合粪便潜血、血清肿瘤标志物、具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度对结直肠癌的诊断效力为AUC=0.887，特异度为98.1%，敏感度为75%，PPV＝0.77，NPV＝0.98。相比较联合五个指标对结直肠癌的诊断效力最高，具有良好的特异度和敏感度。
(6)对于癌前病变组，单独使用具核梭杆菌的丰度作为诊断指标时，特异度为65.2%，敏感度为70.9%，诊断效力AUC=0.741，PPV＝0.66，NPV＝0.70；单独使用Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度作为结直肠癌癌前病变检测指标，特异度为75.0%，敏感度为90.9%，诊断效力AUC=0.818，PPV＝0.77，NPV＝0.81；而联合检测具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度以及粪便潜血对结直肠癌癌前病变的诊断效力AUC=0.827，特异度为75.0%，敏感度为85.7%，PPV＝0.82，NPV＝0.80；进一步联合常规检测粪便潜血、血清肿瘤标志物、具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度对结直肠癌癌前病变的诊断效力AUC=0.846，特异度为90.3%，敏感度为66.7%，PPV＝0.70，NPV＝0.89。相比较联合五个指标对结直肠癌癌前病变的诊断效力最高，但其敏感度未达到较理想水平，因此需进一步挖掘结直肠癌癌前病变的检测指标。
结论：
1.具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌在结直肠癌患者以及腺瘤或息肉患者中检出率明显高于正常人群，与其他地区报道结论一致。
2.在正常人群、癌前病变人群以及结直肠癌人群中具核梭杆菌以及Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度在组间分布具有统计学差异，提示其作为区分三组人群检测指标的潜力。
3.与单独检测具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度相比，联合粪便潜血、血清学肿瘤标志物、具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度对结直肠癌的诊断具有更高的灵敏度和更好的特异性，AUC达到0.887，验证了联合指标是一个良好的诊断结直肠癌的生物学指标。
4.对于诊断为结直肠癌癌前病变的生物学检查，联合粪便潜血、血清肿瘤标志物、具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度对结直肠癌癌前病变的诊断效力AUC=0.846，有较高的特异度，而敏感度稍低，提示应进一步探究结直肠癌癌前病变的生物学指标。
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，随着社会的发展和人们生活方式的改变，该病的发病率和死亡率逐年升高。肠道微生态是一个数量庞大、种类繁多、结构复杂的生态系统。肠道菌群失调时致病菌株及其代谢产物会影响肠黏膜上皮细胞和肠腔微环境，导致肠道疾病的发生。具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌及其代谢产物作用于肠道微生态，与结直肠癌的发病密切相关。目前尚缺乏无创、操作取材简便，特异性好、灵敏度高的检测指标用于对结直肠癌早期患者筛查。研究结直肠癌患者大便标本中致病菌株的种类与丰度与结、直肠癌发生发展的关系，评价其作为诊断标志物的潜能，具有十分重要的临床意义。
目的
分析具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌在我国东南沿海地区正常人群、结直肠癌癌前病变(结直肠腺瘤／息肉)人群以及结直肠癌人群中分布情况。分析致病菌株在结直肠的不同位置，肿瘤不同分期的分布情况。评价检测具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌的丰度是否可作为诊断结直肠癌的生物学指标。
方法
本研究收集2019-01至2019-12来汕头市中心医院就诊的、初次诊断的结直肠癌患者60例，初次诊断为结直肠腺瘤或息肉患者37例，以及正常体检者42例作为主要研究对象，收集研究对象基本资料，收集患者和正常对照的粪便样本及全血样本。通过实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测粪便样本中具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度。应用单因素方差分析统计分析致病菌株在不同研究组别的分布差异。利用ROC曲线评价具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度以及联合粪便潜血作为检测指标在结直肠癌以及结直肠癌癌前病变中的诊断效能。
结果
(1)本研究通过分析扩增曲线及PCR扩增参数Ct值(Cyclethreshold:扩增循环荧光域值)对扩增体系及反应条件进行优化，建立扩增效率高，结果准确的实验方法，为后续科学研究的准确奠定基础。
(2)本研究选取结直肠癌患者60例，癌前病变(腺瘤／息肉)患者37例以及正常对照人群42例。利用优化的qPCR方法对不同人群中具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌进行相对定量分析，结果显示具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌在正常人群的阳性检出率分别为19.05%、21.43%，在腺瘤／息肉患者中为59.46%、59.46%，在结直肠癌患者中为71.67%、68.33%。单因素方差分析结果显示具核梭杆菌的丰度在组间分布具有统计学差异(F=5.221,P=0.008)。Pks基因阳性的大肠杆菌的单因素方差分析结果显示其在三组间分布差异也具有统计学意义(F=6.267,P=0.003)。研究结果提示具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌可作为诊断结直肠癌的有潜力的生物标志物。
(3)进一步研究分析肿瘤位于结直肠的7个不同部位(包括乙状结肠、盲肠、直肠、直肠乙状结肠交界、升结肠、横结肠和降结肠)时，粪便中具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌丰度分布情况，结果显示在不同部位肿瘤组，其具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度的无统计学差异(具核梭杆菌：F=0.813,P=0.67；Pks基因阳性的大肠杆菌：F=2.602,P=0.144))，而在癌前病变组具核梭杆菌的丰度在组间具有统计学差异F=2.887,P=0.045；Pks基因阳性的大肠杆菌丰度分布无统计学差异。
(4)根据肿瘤分期标准(Tumor, Node, Metastasis, TNM)将肿瘤病人进行分组，分析具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌丰度在肿瘤不同分期间的分布差异。结果显示组间分布无统计学差异(具核梭杆菌：F=3.487,P=0.246；Pks基因阳性的大肠杆菌：F=0.912,P=0.617)。提示在肿瘤的不同阶段具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌都保持一定的富集，这为检测指标具有稳定性提供科学依据。
(5)本研究得出单独使用具核梭杆菌的丰度作为结直肠癌的诊断指标时，其特异度为73.9%，敏感度为69.2%，诊断效力ROC曲线下面积(Area Under Curve, AUC)=0.735，阳性预测值(Positive Predictive Value, PPV)=0.79，阴性预测值(Negative Predictive Value, NPV)=0.63;单独使用Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度作为结直肠癌检测指标，其特异度为73.3%，敏感度为93.3%，诊断效力AUC=0.810，PPV＝0.83，NPV＝0.89。而联合检测具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度以及粪便潜血对结直肠癌的诊断效力AUC=0.844，特异度为82.4%，敏感度为84.6%，PPV＝0.82，NPV＝0.85。进一步联合粪便潜血、血清肿瘤标志物、具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度对结直肠癌的诊断效力为AUC=0.887，特异度为98.1%，敏感度为75%，PPV＝0.77，NPV＝0.98。相比较联合五个指标对结直肠癌的诊断效力最高，具有良好的特异度和敏感度。
(6)对于癌前病变组，单独使用具核梭杆菌的丰度作为诊断指标时，特异度为65.2%，敏感度为70.9%，诊断效力AUC=0.741，PPV＝0.66，NPV＝0.70；单独使用Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度作为结直肠癌癌前病变检测指标，特异度为75.0%，敏感度为90.9%，诊断效力AUC=0.818，PPV＝0.77，NPV＝0.81；而联合检测具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度以及粪便潜血对结直肠癌癌前病变的诊断效力AUC=0.827，特异度为75.0%，敏感度为85.7%，PPV＝0.82，NPV＝0.80；进一步联合常规检测粪便潜血、血清肿瘤标志物、具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度对结直肠癌癌前病变的诊断效力AUC=0.846，特异度为90.3%，敏感度为66.7%，PPV＝0.70，NPV＝0.89。相比较联合五个指标对结直肠癌癌前病变的诊断效力最高，但其敏感度未达到较理想水平，因此需进一步挖掘结直肠癌癌前病变的检测指标。
结论：
1.具核梭杆菌和Pks基因阳性大肠杆菌在结直肠癌患者以及腺瘤或息肉患者中检出率明显高于正常人群，与其他地区报道结论一致。
2.在正常人群、癌前病变人群以及结直肠癌人群中具核梭杆菌以及Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度在组间分布具有统计学差异，提示其作为区分三组人群检测指标的潜力。
3.与单独检测具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度相比，联合粪便潜血、血清学肿瘤标志物、具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度对结直肠癌的诊断具有更高的灵敏度和更好的特异性，AUC达到0.887，验证了联合指标是一个良好的诊断结直肠癌的生物学指标。
4.对于诊断为结直肠癌癌前病变的生物学检查，联合粪便潜血、血清肿瘤标志物、具核梭杆菌和Pks基因阳性的大肠杆菌的丰度对结直肠癌癌前病变的诊断效力AUC=0.846，有较高的特异度，而敏感度稍低，提示应进一步探究结直肠癌癌前病变的生物学指标。