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人乳铁蛋白(human Lactoferrin, hLf)是具有多种生物学活性的一种铁结合性糖蛋白, 广泛存在于哺乳动物的乳汁、唾液、眼泪等分泌物中。人乳铁蛋白基因的开放阅读框为2.14kb,蛋白分子量约为80kD 左右。胸腺肽α1(Thymosin alpha 1,Tα1)是一种广泛分布于哺乳动物的各个组织器官中的活性肽,含28 个氨基酸残基,分子量3.108kD,等电点pH=4.2。由于这两个蛋白在人体免疫调节、抗癌和抗病毒等方面具有重要的作用,所以关于他们的研究越来越受到人们的重视。在进行本论文的工作中首先人工合成人乳铁蛋白基因的开放阅读框,并且与本实验室保存的胸腺肽基因融合,然后对融合基因的酵母和生菜表达系统进行了初步的研究。在融合基因表达系统的研究过程中为了提高融合基因的表达量,又引入了透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb)进行了研究。在融合基因的研制中:依据已经公布的人乳铁蛋白基因序列并同时考虑到可实现分别克隆拼接的酶切位点,设计并合成51 个相互重叠的寡核苷酸单链,分9 组退火形成7个基因片段和两个Linker。然后通过克隆、拼接将7 个基因片段合成完整的人乳铁蛋白基因并与胸腺肽基因(100bp 左右)融合,成功的合成了人乳铁蛋白、胸腺肽融合基因(Tα1hLf)。通过测序证明了合成的约2.3kb 的融合基因序列正确,阅读框未发生改变。在毕赤酵母表达融合基因实验中:利用毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建可以在胞内表达vgb 和胞外分泌表达融合基因的载体pPIC9K-vgbTα1hLf。转化酵母后,通过PCR、SDS-PAGE 检测证实融合基因已经整合于酵母基因组并且表达出约83kD 左右的融合蛋白。Western blotting 和抑菌实验表明分泌表达的融合蛋白中人乳铁蛋白具有天然蛋白的活性,从而验证了合成的乳铁蛋白基因和融合基因的正确性。差示光谱分析和贫氧实验表明VHb 具有活性并在贫氧环境中可以促进毕赤酵母的生长和融合蛋白的表达。摇瓶表达实验表明融合蛋白的表达量可以达到30mg/L。在生菜表达融合基因实验中:用pGΩ4A 构建了两种分别由RuBP 启动子和35S 启动子启动融合基因的中间载体,然后将融合基因表达盒与VHb 基因表达盒反向串联并克隆于pBI121 构建出植物表达载体pGBIVHbTα1hL(fvgb 和融合基因均由35S 启动子启动)和pGBIRVHbTα1hLf(vgb 由35S 启动子启动,融合基因由RuBP 启动子启动),利用农杆菌介导法将两种植物表达载体转化生菜并获得46株再生苗。对再生苗进行PCR 检测和用乳铁蛋白抗体ELISA 检测,结果表明融合蛋白已经获得表达。差示光谱分析表明vgb 基因也已经表达且具有活性。