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T型钙通道又称低电压激活钙通道(LVA),其组织分布广泛,并且在机体生理和病理过程中,如神经放电、疼痛、癌症等都发挥重要的作用。因此,研究T型钙通道调节机制有重要意义。然而,由于T型钙通道特异性抑制剂的缺乏,致使T型钙通道调节机制研究受限,发展缓慢。大量研究表明,许多激素和神经递质都可通过激活G蛋白偶联受体(GPCRs)来调控T型钙通道,但具体的调节机制尚不十分清楚。因此,本研究将围绕激活GPCRs来探索T型钙通道的调节机制。此外,还将研究硫化氢气体对DRG神经元中T型钙电流的调节作用。第一部分G蛋白偶联受体对DRG神经元T型钙通道的调节及分子机制的研究目的:研究激活GPCRs对T型钙通道的作用并初步探索其调节的分子机制。包括:(1)μ型阿片受体激动剂DAMGO对DRG神经元中T型钙电流的调节作用。(2)GABAB受体激动剂baclofen对DRG神经元中T型钙电流及过表达在HEK293细胞中CaV3.2电流的调节作用。(3)研究baclofen调节T型钙通道的分子机制。方法:利用全细胞膜片钳技术进行研究。结果:(1)μ型阿片受体激动剂DAMGO(250 n M)可逆性抑制DRG神经元中T型(LVA)和高电压激活钙通道(HVA)钙电流,抑制率分别为41.8±10.4%(n=3)和65.8±6.7%(n=8)。(2)DAMGO对HVA钙电流的抑制作用成浓度依赖性(EC50=17.72±6.9 n M),并且G蛋白βγ亚基一定程度上参与了此抑制过程。(3)在一些DRG细胞中,DAMGO并不能够抑制T型钙电流。(4)GABAB受体激动剂baclofen可逆性抑制DRG神经元中LVA(T型)和HVA钙电流,抑制率分别为22.53±2.05%(n=15)、31.90±3.11%(n=27)。并且此抑制作用可被400 ng/ml PTX部分阻断(P<0.001,n=9~11)。(5)GDP-beta-s能够部分阻断baclofen对HVA钙电流的抑制作用(P<0.05,n=16),但不能阻断baclofen对LVA钙电流的抑制作用(P>0.05,n=6)。(6)DTT能够部分恢复baclofen对LVA(T型)钙电流的抑制作用(P<0.01,n=6),但对baclofen引发的HVA钙电流的抑制作用没有影响(P>0.05,n=14)。(7)GABAB受体激动剂baclofen可逆性抑制与GABAB共表达在HEK293细胞中的CaV3.2电流,抑制率为24.73±1.11%(n=12),并且此抑制作用可被1 m M DTT部分洗脱(P<0.001,n=7)结论:采用全细胞膜片钳的方法发现激活μ型阿片受体和GABAB受体均可抑制T型钙电流,但多数表达T型钙通道的DRG神经元并不表达μ受体。GABAB受体对T型钙通道的调节是由Gαi/o型G蛋白介导的,并且还涉及氧化还原调节途径。第二部分硫化氢对DRG神经元T型钙通道的调节作用目的:观察硫化氢对DRG神经元上T型钙通道的调节作用方法:利用全细胞膜片钳技术进行研究。结果:(1)Na HS在低浓度时能够选择性抑制DRG神经元上的T型钙电流,并且在100μM(n=5)、300μM(n=6)、1 m M(n=6)三个浓度梯度时,对T型钙电流的抑制率成浓度依赖性。Na HS对HVA钙电流没有作用(P>0.05,n=11)。(2)Na HS在高浓度时(3 m M,10 m M)增大T型钙电流。(3)高浓度Na HS对T型钙电流的增大作用主要是Na+引起,而不是H2S本身的作用。将10 m M Na HS替换成10 m M Na Cl时,后者同样能够增大T型钙电流,虽然10 m M Na Cl的增大作用似乎略小与10 m M Na HS的增大作用(P=0.07,n=5)。结论:本实验结果表明,H2S能够抑制DRG神经元上的T型钙电流,并且在较低浓度范围内抑制率呈浓度依赖性。高浓度的Na HS对T型钙电流有增大作用,但并不是通过H2S的作用,而可能是其所含的Na+引起。