一、背景和目的梗阻性黄疸一直被认为是外科的急症和重症,其发病率较高,主要病因为肝内外胆管结石,肿瘤和狭窄等疾病。随着医疗技术的不断发展,内镜和超声内镜在解除梗阻,明确病因方面起了非常关键的作用。但是梗阻性黄疸造成肝脏的损害,严重影响肝功能。即使在有效解除梗阻后,仍需长期治疗才能使肝功能恢复或接近正常水平,严重病例可导致不可逆性肝损害。目前尚无系统的临床和基础研究观察梗阻性黄疸对肝细胞损害的进展过程,以及黄疸解除后肝脏逐渐恢复的动态过程,因而缺乏以梗阻性黄疸引流后肝细胞状态为客观依据选择治疗方法的临床治疗方案,而胆管梗阻、胆汁淤积又是常见的病理环境,也是临床治疗的难题,其相关发病机制的基础研究具有现实意义。肝胆运输系统(Hepatobliary transport system)是一类参与胆汁成分形成、摄取和排泌的蛋白的统称。目前已经发现超过30种,分布于肝细胞的基底膜(肝血窦面)和顶膜(毛细胆管面)、胆管上皮细胞、小肠上皮和远端肾小管,功能各异。正常生理情况下,肝细胞表面存在两类胆酸运输基(Bile transporter):肝基底运输基(Basolateral transporter)和肝小管运输基(Canalicular transporter)。这两类运输基分别从血循环中吸收胆酸和向胆汁中泵出胆酸,从而维持胆酸在肝细胞中的平衡。在胆汁的形成与分泌过程中,肝胆运输系统扮演着活跃的角色,它不仅参与正常胆汁流的形成,而且参与了肝脏排出各种各样的内源性和外源性化学物质如胆汁酸、胆红素、胆固醇、磷脂、激素药物及各种毒性物质,以最大限度的保护肝脏。但是在炎症和梗阻的环境下,肝脏胆道运输系统发生失衡,运输基表达发生改变,肝细胞内胆酸水平升高产生胆酸毒性,从而造成肝细胞损害。目前对于梗阻性黄疸情况下,肝胆运输系统的改变发生机制作用尚不十分清楚。因此,本研究通过建立大鼠胆管梗阻及再通模型,在此模型基础上连续观察梗阻性黄疸时以及解除黄疸后的病理过程,通过RT-PCR和免疫组化技术,从mRNA和蛋白等不同水平上评价肝脏损害的程度,探讨这一病理过程中肝胆运输系统的变化规律,初步了解其分子机制,从而为临床上防止或减慢肝脏纤维化的进程提供宝贵的依据。二、材料与方法选取健康雄性Wistar大鼠72只,体重250-300克,随机分成三组：分为A假手术组(Sham operation,SO组,n=24)、B梗阻性黄疸组(Obstructive jaundice, OJ组,n=24)和C梗阻后再通组(Obstruction recanalization,OR组,n=24)。A组为对照组,行假手术；B组为实验组,行胆总管置管结扎；C组为实验组,行胆总管置管结扎7天后再通。分别于手术、置管结扎及再通后第1、3、7天处死动物,留取标本,每个预定时相点取8只大鼠,留取血液送化验室检测肝功能；留取肝右叶应用10%甲醛固定,留作HE染色及免疫组化；留取肝左叶-80℃冻存,留作RT-PCR检测。1、应用全自动生化分析仪对大鼠血清中TBIL、ALT、TBA的含量进行检测,分析各组大鼠肝功能的变化。2、通过HE染色观察胆管梗阻不同时间点大鼠肝组织的病理学改变。3、通过RT-PCR技术,检测JNTCP、BSEP、MRP2等肝胆运输系统的mRNA分子表达情况,观察不同时间点各基因的变化规律。4、通过免疫组化技术,观察NTCP、BSEP、MRP2在不同时间点蛋白的表达情况。三、结果1、动物模型情况成功建立了大鼠胆管梗阻/再通的动物模型。SO组共造模24只,术后全部存活,至各时相点处死时无死亡。OJ组共造模27只,术后死亡3只,死亡率为11.1%。OR组共造模28只,术后死亡4只,死亡率为14.3%。两实验组(OJ组和OR组)之间死亡率比较无统计学差异(P>0.05)。SO组造模全部成功。OJ组和OR组在造模过程中除出现动物死亡外,还有导管脱出、导管堵塞等常见并发症发生,但这些并发症在两实验组之间并无明显差异,OJ组和OR组动物模型制作的成功率分别为77.8%和75.0%,相比无统计学差异(P>0.05)。2、肝功能结果SO组大鼠术后各时相点血清中TBIL、ALT、TBA含量无明显差别(P>0.05)。OJ组大鼠梗阻后各时相点血清中TBIL、ALT、TBA含量明显升高,较之SO组各对应时相点具有明显差别(P<0.05)。OR组大鼠再通后各时相点血清中TBIL、ALT、 TBA含量均有所下降,再通后第7天基本降至SO组水平(P>0.05)。3、HE染色结果S0组大鼠术后各时相点肝细胞形态正常,显示正常肝小叶结构,肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列,均无肝细胞坏死。OJ组大鼠梗阻后第1天可见肝组织中少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润；第3天可见新增生的细小胆管和无管腔的小胆管,嗜中性粒细胞和淋巴细胞浸润较术后第1天明显增加,肝细胞轻度变性,可见少量灶状和片状坏死,肝组织汇管区可见胆管增生和纤维组织细胞增生,偶见胆管扩张；第7天可见肝细胞出现变性坏死的程度加重,部分肝小叶正常结构丧失,肝细胞肿胀,排列紊乱,疏松变性,核染色加深,小叶间质炎症,胆管上皮细胞增生明显,可见纤维细胞增生,其管壁周围炎症细胞浸润。OJ组大鼠随着时间的进展,肝脏损伤、纤维化程度逐渐加重。OR组大鼠再通后第1天可见肝细胞出现变性坏死的程度有所减轻,小叶间仍可见炎症细胞浸润、胆管增生和纤维细胞增生；第3天可见肝细胞变性坏死的程度进一步缩小和减轻,可见部分纤维细胞增生,其管壁周围少量炎症细胞浸润；第7天可见大鼠肝组织形态基本恢复正常。4、RT-PCR结果S0组大鼠术后各时相点肝组织中NTCP、BSEP、MRP2的mRNA表达无明显差别(P>0.05)。OJ组大鼠梗阻后各时相点肝组织中NTCP、BSEP、MRP2的mRNA表达逐渐减弱,与SO组各对应时相点比较有显著差别(P<0.05),且术后第7天表达最弱。OR组大鼠再通后各时相点肝组织中NTCP、BSEP、MRP2的mRNA表达逐渐增强,再通后第7天基本恢复至S0组水平(P>0.05)。5、免疫组化结果S0组大鼠术后各时相点肝组织中NTCP、BSEP、MRP2在肝细胞膜上规则表达,显露出肝细胞轮廓,无明显差别(P>0.05)。0J组大鼠梗阻后第1天肝组织中NTCP、BSEP、MRP2在肝细胞膜上表达不规则,染色稀疏散乱；第3天表达更加不明显,染色更为稀疏散乱；第7天肝组织中未见明显表达。OJ组大鼠梗阻后各时相点与S0组比较均明显下调(P<0.05)。OR组大鼠再通后第1天肝组织中可见NTCP、BSEP、MRP2在肝细胞膜上表达,但染色稀疏散乱;第3天表达增强,但在肝细胞膜上表达仍不规则；第7天表达基本恢复至S0组水平(P>0.05)。四、结论1、大鼠胆管梗阻/再通的动物模型建立,较好地模拟了临床上梗阻性黄疸及再通的病理生理过程,重复性及稳定性好,手术简单易行,成功率较高。2、在大鼠胆管梗阻及再通的过程中,肝功能随时间发生相应改变,肝脏组织出现不同程度的病理表现,NTCP、BSEP、MRP2等肝胆运输系统在基因和蛋白水平的表达也随不同时间点发生相应变化,与对应时相点血清肝功能指标变化相一致。3、实验进一步证实了胆汁淤积性疾病的发病机制与肝胆运输系统的表达有关,NTCP、BSEP、MRP2的时序性变化可能是大鼠梗阻性黄疸后肝内胆汁淤积发生的重要机制之一。