论文部分内容阅读
目的:纤维环是椎间盘的重要组成部分,其结构稳定性对维持椎间盘的力学承载至关重要。多项研究表明,外界力学刺激对椎间盘的结构和功能呈双向调控,且主要与力学作用的幅度相关。其中,过度力学刺激可导致纤维环撕裂,引起纤维环炎症反应发生,最终导致椎间盘退变。相反,适度力学刺激则能抑制炎症反应,对纤维环起保护作用。但是力学调控纤维环炎症反应的相关机制尚不清楚。近期研究表明,胞膜小凹的核心蛋白小凹蛋白1（Caveolin-1,Cav1）在细胞感应及传导外界力学刺激及细胞炎症反应过程中发挥重要的作用。因此,本研究旨在深入探索适度力学刺激对纤维环细胞炎症反应的影响以及Cav1在其中的作用机制。具体目标:（1）通过对纤维环细胞施加不同幅度力学刺激,研究力学条件的改变对纤维环细胞形态、增殖、迁移及基质合成代谢的影响,筛选出有益于细胞生长的合适力学刺激条件;（2）通过探究不同幅度力学刺激对纤维环细胞炎症反应的差异性调控,进一步验证具有抑制纤维环炎症反应的力学刺激,并筛选出相关基因及信号通路。（3）通过转染Cav1的过表达或干扰质粒,明确Cav1在力学调控的纤维环炎症反应过程中的重要作用及调控机制;（4）体内动物模型分析适度力学牵引对早期退变椎间盘的修复作用。方法:（1）对培养于拉伸皿中的纤维环细胞施加不同幅度（0%、2%、5%及12%）的周期性应力刺激。通过骨架染色观察细胞形态;通过流式技术判断细胞增殖情况;通过划痕实验分析细胞迁移速率;通过细胞免疫化学方法检测细胞外基质分泌情况。（2）通过RT-qPCR检测0%、5%及12%CTS条件下,纤维环细胞中促炎基因（Cox2、Tnfa、Il1b及Il6）的表达。此外,利用IL-1β诱导纤维环细胞炎症反应发生后再施加5%CTS。通过RT-qPCR检测5%CTS处理后对发生炎症反应的纤维环细胞中促炎基因表达的影响。进一步通过转录组测序筛选各力学条件下差异性表达的基因群。（3）通过Western Blot分析不同幅度（0%、5%及12%CTS）力学刺激对纤维环细胞中Cav1及integrin β1表达的影响;通过免疫荧光检测不同幅度力学刺激对细胞中Cav1、integrin β1及NF-κB定位的影响;分别抑制及过表达Cav1分析其在力学调控的纤维环炎症反应过程中的作用。通过Western Blot、免疫荧光及蛋白质免疫共沉淀等分析Cav1与integrinβ1、NF-κB之间的调控关系。（4）对早期退变的大鼠尾椎椎间盘施加适度力学牵引后,通过核磁共振观察髓核含水量变化;通过H＆E染色及番红快绿染色观察组织形态改变;通过免疫组化分析Cav1、p-p65、COX-2及Collagen I的表达变化。结果:（1）在静态培养条件下纤维环细胞呈扁平状,且无规律生长。予以2%CTS处理后,细胞趋于变细,但仍无规律生长。而予以5%CTS处理后,细胞变细且平行于拉伸方向生长;12%CTS刺激后,细胞呈细长梭形,并趋于垂直于拉伸方向生长。通过流式分析技术发现,5%CTS可显著增加进入S期的细胞数目,而12%CTS显著降低S期的细胞数目,说明5%CTS可促进纤维环细胞增殖。细胞划痕实验结果表明5%CTS可促进纤维环细胞迁移速率,而12%CTS条件下细胞迁移速率最慢。细胞免疫化学结果表明5%CTS可促进细胞外基质（Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖）表达,而12%CTS条件下细胞外基质表达显著降低。（2）12%CTS则显著上调炎症基因的表达,而5%CTS对炎症基因表达的影响并不显著。此外,IL-1β处理后的细胞炎症基因表达上调,当予以5%CTS的适度力学刺激后,炎症基因表达再次降低,说明5%CTS具有抑炎作用。转录组测序结果表明12%CTS可以显著上调炎症反应、分解代谢及凋亡信号通路,而细胞增殖过程受到抑制。5%CTS可促进小分子生物合成过程、细胞外基质重塑及细胞增殖。（3）12%CTS条件下Cav1和integrin β1蛋白表达水平升高,而5%CTS条件下二者蛋白表达水平降低;在不同力学条件刺激下Cav1及integrin β1均主要定位于细胞质及细胞膜,NF-κB在静态及5%CTS条件下主要定位于细胞质,而予以12%CTS刺激后转移入细胞核;抑制Cav1表达会抑制12%CTS诱导的纤维环炎症反应,而过表达Cav1可部分削弱5%CTS引起的抗炎效应;Cav1与integrin β1之间存在直接相互作用关系,而Cav1与NF-κB不存在直接相互作用,但Cav1过表达可以促进NF-κB活性增加并能促进NF-κB核转入。（4）早期退变的椎间盘予以动态牵引2周可部分恢复髓核含水量、椎间隙及纤维环结构,且动态牵引效果要优于自我修复。此外,免疫组化结果表明在正常椎间盘组织中Cav1、p-p65及COX-2的表达较低,而椎间盘退变时表达升高,当椎间盘逐渐修复后表达再次降低。Collagen Ⅰ的表达与上述蛋白表达趋势相反,退变椎间盘组织中表达较低,而椎间盘修复后表达升高。结论:综上所述,我们的研究表明过度力学刺激可诱导纤维环细胞炎症反应,这一过程依赖于Cav1及integrin β1介导的NF-κB信号通路。适度力学刺激则抑制Cav1介导的信号通路,一定程度上拮抗纤维环细胞的炎症反应。体内实验结果表明,适度的力学牵引可修复退变的椎间盘。这些成果为人们理解适度运动的对退变组织康复治疗提供了理论基础,同时靶向Cav1及integrinβ1介导的NF-κB信号通路有望成为治疗椎间盘退变的新方法。