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恶性肿瘤发生过程中会产生一系列的细胞学和遗传学突变,导致癌基因的激活,抑癌基因的失活。大部分的恶性肿瘤细胞都拥有一些共同的特征,包括很强的增殖活性,组织侵袭性和转移,细胞生长信号通路的失调,持续的血管发生,抑制各种细胞死亡通路等等。近来研究表明,肿瘤细胞能够通过一些特殊的机制逃避免疫系统的清除作用。CD47作为抗吞噬作用的信号分子,在肿瘤的免疫监视中发挥着重要作用,肿瘤细胞可以通过上调CD47的表达抑制吞噬作用。在对于白血病的研究中发现,许多类型白血病细胞及白血病干细胞的CD47表达都高于正常水平。CD47与巨噬细胞上受体信号调节蛋白α(SIRPα)的相互作用传递抑制信号,阻止肿瘤细胞被吞噬细胞清除。而采用抗CD47单克隆抗体阻断这一信号通路后,能够促进巨噬细胞对肿瘤细胞的清除作用,具有治疗意义。目前已在急性髄系白血病,非霍奇金淋巴瘤,急性淋巴细胞白血病中得到了验证,而CD47-SIRPα信号通路作用的深入分子机制还有待进一步研究。肿瘤细胞上的高表达的CD47需要与巨噬细胞上受体SIRPα相结合才能发挥作用,我们通过原核表达系统获得包含结合位点的可溶性CD47胞外段蛋白,发挥“占位”作用,与肿瘤细胞表面的CD47竞争结合SIRPα,从而阻断CD47-SIRPα信号通路,促进巨噬细胞对肿瘤细胞的清除作用。与CD47单克隆抗体有异曲同工之处。我们希望通过这一方法进一步研究CD47在白血病治疗中作用的深入分子机制,对于白血病及其他恶性肿瘤的靶向治疗具有重要意义。为此我们进行了如下工作:1.原核表达可溶性CD47胞外段蛋白。用PCR技术以人淋巴结cDNA为模板扩增出人CD47分子的胞外段,测序正确后将其插入原核表达载体pET32a(+)中,获得表达载体pET32a-hCD47ext。之后将表达载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导蛋白表达,优化表达条件,使目的蛋白获得最佳表达,扩大表达后用针对His标签的镍金属螯合柱纯化,蛋白裂解后获得纯的TrxHis-hCD47ext蛋白。用SDS-PAGE及Western blot分析蛋白的表达情况及蛋白大小的正确性。2.可溶性CD47胞外段蛋白TrxHis-hCD47ext与其受体SIRPα的结合。将我们表达的CD47胞外段蛋白添加到培养的巨噬细胞的上清中,用抗His的抗体通过流式细胞仪间接检测结合后细胞表面荧光强度的变化,从而验证TrxHis-hCD47ext是否能够与SIRPα相结合。3. TrxHis-hCD47ext对人急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat的作用。为了验证可溶性的CD47胞外段蛋白是否能够阻断CD47-SIRPα信号通路,从而促进巨噬细胞对白血病细胞的清除作用,我们采用Dio标记的Jurkat细胞与巨噬细胞共培养的方法,将TrxHis-hCD47ext添加到共培养的上清中,用荧光显微镜观察蛋白作用后巨噬细胞对白血病细胞的吞噬作用的变化,同时验证TrxHis-hCD47ext的活性及功能。结论:1.实现了人CD47胞外段蛋白在原核表达系统中的可溶性表达,获得了纯的TrxHis-hCD47ext蛋白。2.验证了我们所表达的CD47胞外段蛋白能够与巨噬细胞上受体SIRPα很好的结合。3.通过Jurkat细胞与巨噬细胞共培养的方法,验证了TrxHis-hCD47ext蛋白的活性,并证明该蛋白能够促进巨噬细胞对Jurkat细胞吞噬作用。